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研究目的:胶质瘤是一种最常见的恶性脑瘤,也是最难治疗的癌症之一,由于肿瘤组织的浸润性生长,很难通过手术完全切除。目前标准治疗手段是手术切除结合分级放疗并辅助以替莫唑胺治疗和/或靶向药物。随着对代谢重编程在肿瘤病理机制的关键作用的深入认识,以肿瘤细胞代谢特征为靶点的肿瘤治疗策略日益引起人们的关注,但尚未取得显著的研究结果。其主要原因是以抑制肿瘤细胞代谢,特别是以单一酶为靶点抑制单一代谢通路的策略无法克服肿瘤代谢的肿瘤代谢的异质性和可塑性。本课题组发现的小分子化合物ZZZ-1对各种异质性恶性胶质瘤细胞具有显著的体内外药效,且前期研究结果显示其参与肿瘤细胞能量代谢调控。本研究旨在研究ZZZ-1对胶质瘤代谢的调控作用,特别是促进线粒体氧化代谢并抑制合成代谢的作用以及伴随的癌细胞生物学特征的改变,从而阐明其抗胶质瘤的新颖作用机制。研究内容:(1)为探究ZZZ-1对胶质瘤细胞增殖的影响,以多株胶质瘤细胞株为研究对象,以已知能量代谢调控物质2-脱氧葡萄糖(2-DG)、二氯乙酸(DCA)和二甲双胍(Metformin)为阳性对照,采用SRB法考察了 ZZZ-1对细胞增殖的影响;进一步以原代胶质瘤细胞Tumor 3和Tumor4为研究对象,采用Annexin-V FITC/PI染色法结合流式细胞技术考察了 ZZZ-1对细胞凋亡的影响。(2)为探究ZZZ-1对胶质瘤细胞葡萄糖和谷氨酰胺相关生化指标的影响,采用生化试剂盒检测法考察了 ZZZ-1对葡萄糖消耗和乳酸产生的影响,并用LC-MS法考察了其对谷氨酰胺消耗的影响;其次,采用生化试剂盒检测法比较了 2-DG与ZZZ-1对胶质瘤细胞C6的ATP产生的影响,并考察了 ZZZ-1与氧化磷酸化抑制剂OM单用及合用对胶质瘤细胞ATP产生的影响。(3)为探究胶质瘤细胞中葡萄糖和谷氨酰胺代谢特征,以U87MG细胞为研究对象,分别用稳定同位素标记的葡萄糖(13C-Glc)和谷氨酰胺(13C-Gln)孵育细胞并结合LC-MS,示踪了二者在细胞中的代谢流向,分析了其在胶质瘤细胞中的代谢特征。(4)为探究ZZZ-1对葡萄糖和谷氨酰胺参与的分解代谢通路的影响,以U87MG细胞为研究对象,分别用稳定同位素标记的葡萄糖(13C-Glc)和谷氨酰胺(13C-Gln)孵育细胞并结合LC-MS,考察了 ZZZ-1处理后细胞内外一系列分解代谢通路中间产物的变化,包括糖酵解和三羧酸循环代谢中间产物及其转化的氨基酸的变化;进一步采用LC-MS法考察了 ZZZ-1对多株胶质瘤细胞的糖酵解和三羧酸循环中间产物影响验证了上述变化的普遍性,并且考察了 NADH与NAD+的含量及比例、ATP与ADP含量及比例的变化以探究ZZZ-1对氧化磷酸化的影响。(5)为探究ZZZ-1对葡萄糖和谷氨酰胺参与的合成代谢通路的影响,首先考察了 ZZZ-1处理后线粒体和胞浆中三羧酸循环中间产物及Gln、Glu浓度的变化,分析其对线粒体和胞浆之间的代谢联系的影响;其次,以U87MG细胞为研究对象,分别用稳定同位素标记的葡萄糖(13C-Glc)和谷氨酰胺(13C-Gln)孵育细胞并结合LC-MS,考察了 ZZZ-1处理后细胞内由葡萄糖和谷氨酰胺代谢中间产物衍生的参与核苷酸从头合成的氨基酸及其下游核苷酸产物含量的变化。(6)为考察ZZZ-1对细胞氧化还原稳态的影响,为探究ZZZ-1对胶质瘤细胞氧化还原稳态的影响,以多株胶质瘤细胞为研究对象,采用LC-MS方法考察了ZZZ-1处理后细胞内NADPH和NADP+含量的变化及细胞内外GSH、GSSG和谷胱甘肽合成所需氨基酸水平的变化;进一步以Tumor3为研究对象,分别采用荧光探针DCFH-DA和JC-1,考察ZZZ-1处理后ROS和MMP随时间的变化;其次,为探究ZZZ-1诱导氧化还原稳态的破坏与细胞活力降低及细胞形态改变的关系,引入了 ROS清除剂GSH、NAC和氧化磷酸化抑制剂OM,考察了 ZZZ-1单用及其与ROS清除剂和氧化磷酸化抑制剂合用对细胞活力和细胞形态的影响。实验结果:(1)与已知代谢调控物质(2-DG、DCA和Metformin)相比,ZZZ-1能更强效、更广泛地抑制胶质瘤细胞增殖,并显著诱导胶质瘤细胞凋亡。(2)ZZZ-1在短时间点内广泛地增加胶质瘤细胞葡萄糖的消耗、抑制乳酸的产生并调控谷氨酰胺的利用;同时广泛地增加来源于葡萄糖和谷氨酰胺的糖酵解和部分三羧酸循环中间产物的水平,并伴随着NADH和ATP水平升高,表明ZZZ-1促进葡萄糖和谷氨酰胺进入三羧酸循环并进行氧化磷酸化。(3)在胶质瘤细胞中,葡萄糖主要参与糖酵解、磷酸戊糖旁路和嘌呤合成,部分参与三羧酸循环,而谷氨酰胺则主要参与三羧酸循环嘧啶碱基合成和谷胱甘肽合成,二者各有侧重,但又相互配合。(4)ZZZ-1增加线粒体中来源于葡萄糖和谷氨酰胺的代谢中间产物含量,同时使胞浆中相应的代谢产物减少;并降低葡萄糖和谷氨酰胺衍生的氨基酸及其下游核苷酸产物的水平,表明线粒体与胞桨的代谢联系受到抑制,葡萄糖和谷氨酰胺被限制于线粒体进行分解代谢而不流入生物合成通路。(5)ZZZ-1可以广泛地破环GSH/GSSG平衡、NADPH/NADP+平衡,抑制GSH合成并促进GSSG释放,从多角度破坏胶质瘤细胞的氧化还原稳态,最终导致细胞ROS堆积和线粒体膜电位降低,并且这种破坏不能被ROS清除剂逆转。研究结论:ZZZ-1可以同时逆转胶质瘤细胞的葡萄糖和谷氨酰胺代谢特征,表现为促进二者进入三羧酸循环并进行氧化磷酸化,导致细胞生物合成抑制和氧化应激,最终使细胞走向死亡。这种通过逆转肿瘤细胞能量代谢方式使其按正常细胞使用葡萄糖和谷氨酰胺的作用方式,可克服胶质瘤细胞的代谢可塑性和异质性,在胶质瘤治疗方面有重要意义。