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猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是猪群中引起免疫抑制的重要病原体,能诱导细胞发生凋亡。目前疫苗免疫仍然是预防该疾病的主要手段,但因PCV2毒株变异快、疫苗保护期短、现有疫苗交叉保护效果差等问题,单纯的疫苗免疫不能根除PCV2的感染。PCV2属于免疫抑制性病毒,在与宿主共同进化时,为了逃避宿主免疫系统的识别和清除,不断建立复杂的机制来生存,依靠单一药物很难高效控制复杂的PCV2感染。本课题组前期已证实苦参碱具有抗PCV2作用,诸多文献证明蛇床子素具有抗炎、抗凋亡、增强免疫功能等药理活性。以传统中药复方为理论依据,将中药活性成分进行合理配伍设计,形成药物成分明确、作用机理清楚的组分组方,有利于多途径多靶点的治疗疾病。目前尚未有关于中药活性成分联合用药防控PCV2的文献报道。本研究运用Rev Man 5.3软件对从中英文文献数据库中检索出关于苦参（苦参碱是其主要活性成分）联合蛇床子（蛇床子素是其主要活性成分）的临床治愈率和总有效率进行Meta分析,结果显示,苦参联合蛇床子配伍安全、临床疗效好。因此,本研究以苦参碱与蛇床子素为组方来源,通过分别建立PCV2感染和Cap转染PK-15细胞模型、PCV2感染昆明小鼠模型,分别从体内外探究苦参碱与蛇床子素协同抗PCV2作用及其抗凋亡机制。体外试验结果表明:1.分别用CPE法和CCK8法检测蛇床子素、利巴韦林、苦参碱联合蛇床子素对PK-15细胞的细胞毒性。在试验设计的浓度范围内,蛇床子素、利巴韦林、苦参碱联合蛇床子素在PK-15细胞上的最大安全浓度分别是0.01 mg/mL、0.5 mg/mL、0.5mg/mL+0.01 mg/mL。2.分别采用qPCR、IFA、Western blot检测PCV2感染PK-15细胞2 h后,加入药物作用48 h时PCV2 Cap基因和蛋白的表达。检测结果显示,与PCV2感染组相比,苦参碱联合蛇床子素（0.5 mg/mL+0.01 mg/mL、0.25 mg/mL+0.01 mg/mL、0.125 mg/mL+0.01mg/mL）显著降低Cap基因和蛋白的表达（P<0.05）且存在剂量依懒性;与单独的0.5mg/mL苦参碱、0.01 mg/mL蛇床子素相比,苦参碱联合蛇床子素高中低三个剂量均显著降低Cap基因和蛋白的表达（P<0.05）;与0.5 mg/mL的利巴韦林阳性对照组相比,苦参碱联合蛇床子素（0.5 mg/mL+0.01 mg/mL）显著降低Cap基因和蛋白的表达（P<0.05）。结果表明苦参碱联合蛇床子素具有协同抗PCV2感染PK-15细胞的作用。3.分别用Annexin V-FITC/PI、JC-1和Western blot检测细胞凋亡率、线粒体膜电位电位（MMP）和相关凋亡蛋白的变化。Annexin V-FITC/PI结果显示,与细胞对照组相比,PCV2感染组的细胞凋亡率显著升高（P<0.05）;与PCV2感染组相比,苦参碱联合蛇床子素高中低剂量组的细胞凋亡率均显著降低（P<0.05）。该结果表明PCV2感染能诱导PK-15细胞凋亡,而苦参碱联合蛇床子素能抑制PCV2诱导的细胞凋亡。JC-1结果表明,与细胞对照组相比,PCV2感染组MMP显著升高（P<0.05）;与PCV2感染组相比,苦参碱联合蛇床子素高中低剂量组均显著降低MMP（P<0.05）。提示苦参碱联合蛇床子素可通过调节线粒体膜电位抑制PCV2诱导的细胞凋亡。Western blot结果显示,与细胞对照组相比,PCV2感染组GRP78、p-PERK、p-e IF2α、ATF4、CHOP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase 9和Bax蛋白的表达显著升高（P<0.05）,Bcl-2蛋白的表达显著降低（P<0.05）;与PCV2感染组相比,苦参碱联合蛇床子素高中低剂量组均显著降低GRP78和PERK通路中促凋亡蛋白的表达（P<0.05）,显著升高抑凋亡蛋白Bcl-2的表达（P<0.05）;苦参碱联合蛇床子素（0.5 mg/mL+0.01 mg/mL）显著降低Cleaved-caspase 9的表达（P<0.05）。表明苦参碱联合蛇床子素可能靶向GRP78,通过PERK通路,抑制PCV2诱导的细胞凋亡。4.建立Cap转染PK-15细胞模型,Western blot检测Cap蛋白、GRP78蛋白和PERK通路中凋亡蛋白的变化。结果表明,与细胞对照组相比,Cap转染组的Cap、GRP78和PERK通路中促凋亡蛋白的表达显著升高（P<0.05）,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低（P<0.05）;与Cap转染组相比,苦参碱联合蛇床子素高中低剂量组均显著降低Cap、GRP78以及PERK通路中促凋亡蛋白的表达（P<0.05）,显著升高抑凋亡蛋白Bcl-2的表达（P<0.05）。结果表明苦参碱联合蛇床子素可能靶向Cap和GRP78,通过PERK通路,抑制Cap蛋白诱导的细胞凋亡。体内试验结果表明:1.分别采用PCR、qPCR检测PCV2感染小鼠5 d血液和各组织中Cap基因的变化。PCR结果显示,PCV2感染组小鼠的血液和肝脏、胸腺、脾脏、腹股沟淋巴结、肺脏中均能检测到Cap基因。qPCR结果显示,PCV2感染组小鼠肝脏中Cap基因表达量最高（8.26×105copies/μL）,其次是胸腺（2.28×105copies/μL）和脾脏（1.13×105copies/μL）,表明PCV2感染昆明小鼠模型建立成功。2.qPCR检测PCV2感染小鼠8 d（用药3 d）、11 d（用药6 d）、14 d（用药9 d）各试验组肝脏中Cap基因的变化时发现,与PCV2感染组相比,苦参碱联合蛇床子素高中剂量组均显著降低Cap基因的表达（P<0.05）且存在剂量依懒性;与单独的苦参碱、蛇床子素或利巴韦林组相比,PCV2感染小鼠8 d（用药3 d）时,不同浓度的苦参碱联合蛇床子素对Cap基因的表达均无显著影响（P>0.05）;PCV2感染小鼠11 d（用药6 d）和14 d（用药9 d）时,苦参碱联合蛇床子素高中剂量组显著降低Cap基因的表达（P<0.05）。Western blot检测PCV2感染小鼠11 d（用药6 d）肝脏中Cap蛋白的表达时发现,与正常对照组相比,PCV2感染组Cap蛋白表达量显著升高（P<0.05）;与PCV2感染组相比,苦参碱联合蛇床子素高中低剂量组均显著降低Cap蛋白的表达且存在剂量依赖性。与单独的苦参碱、蛇床子素或利巴韦林组相比,苦参碱联合蛇床子素高剂量组Cap蛋白的表达显著降低（P<0.05）。结果表明,苦参碱联合蛇床子素可以抑制PCV2感染昆明小鼠。3.免疫组织化学（Immunohistochemical,IHC）方法检测PCV2感染小鼠11 d（用药6 d）脾脏中Cleaved-caspase 3的变化,结果显示,苦参碱联合蛇床子素可抑制凋亡蛋白Cleaved-caspase 3的表达。Western blot检测脾脏中GRP78蛋白、PERK通路中各凋亡相关蛋白的变化。结果显示,与正常对照组相比,PCV2感染组GRP78和PERK通路中促凋亡蛋白的表达显著升高（P<0.05）,Bcl-2的表达显著降低（P<0.05）;与PCV2感染组相比,苦参碱联合蛇床子素高中剂量组均显著降低GRP78、p-PERK、p-e IF2α、ATF4、CHOP、Cleaved-caspase 3和Bax蛋白的表达（P<0.05）、显著升高Bcl-2蛋白的表达（P<0.05）;与单独的苦参碱、蛇床子素或利巴韦林组相比,苦参碱联合蛇床子素高剂量组显著降低GRP78、p-PERK、CHOP和Cleaved-caspase 3蛋白的表达,显著升高Bcl-2的表达（P<0.05）,对p-e IF2α、ATF4和Bax蛋白的表达无显著影响（P>0.05）。结果表明苦参碱联合蛇床子素可能靶向GRP78,通过PERK通路,抑制PCV2诱导的脾细胞凋亡。本研究证实:苦参碱联合蛇床子素在体内外具有协同抗PCV2作用,并阐明其通过GRP78激活的PERK通路抑制PCV2诱导的细胞凋亡。该结果为后续探究苦参碱联合蛇床子素以Cap、GRP78为治疗靶点,研发抗PCV2新药提供了理论依据。