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CRISPR/Cas9系统是继锌指核酸酶(ZFNs)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术后新的基因编辑技术。与ZFNs和TALENs相比,CRISPR/Cas9系统具有操作简单,花费低的优点。CRISPR/Cas系统有三种类型,即I型、II型和III型,其中II型是最为简单的,人们将其改为基因组定点修饰技术,即CRISPR/Cas9系统。CD44是一组分布极为广泛的多分子形式的膜整合糖蛋白,可以在细胞中介导粘附作用,参与细胞之间特异性粘连过程,包括细胞与细胞之间,细胞与基质之间等。大量研究表明,CD44分子在许多恶性肿瘤中表达,参与肿瘤的发生及其调控,但当前CD44分子的作用机制尚不明确,所以,建立CD44表达降低的小鼠黑色素瘤(B16F10)细胞研究其CD44蛋白的作用有重要的意义。研究目的:利用CRISPR/Cas9系统基因编辑技术,在小鼠黑色素瘤细胞中建立CD44表达降低的细胞株,并以CD44表达降低的细胞为研究对象,进行各种生物学活性的检测。研究方法:(1)对CD44基因设计sgRNA序列,sg RNA序列与线性化的PX459质粒连接形成重组质粒,经测序验证,构建出sg RNA/Cas9表达载体。(2)通过电转化将重组质粒转染B16F10细胞,通过流式细胞仪和Western Blot检测重组质粒对B16F10细胞的影响。(3)划痕实验检测CD44蛋白降低后对B16F10细胞迁移能力的影响。(4)MTT法测定CD44蛋白降低后对B16F10细胞增殖能力的影响。(5)流式细胞实验检测CD44蛋白降低后对B16F10细胞凋亡的影响。实验结果:成功构建出针对CD44基因特异性靶位点的重组质粒sg RNA2和sg RNA3;电转染B16F10细胞后经流式和Western Blot鉴定,CD44蛋白表达降低;选取蛋白降低的B16F10细胞经划痕实验验证,CD44表达降低后的B16F10细胞迁移能力下降;选取蛋白降低的B16F10细胞经MTT实验验证,CD44表达降低后的B16F10细胞增殖能力下降;选取CD44蛋白降低的B16F10细胞经流式结果显示,CD44表达降低会使B16F10细胞凋亡显著增加。结论:CRISPR/Cas9技术能够降低B16F10细胞中的CD44蛋白,通过CD44蛋白的降低,进而实现对B16F10细胞迁移能力的影响,进一步实验表明,CD44蛋白降低会引起B16F10细胞活力降低和细胞凋亡变化,使细胞增殖降低。本实验结果有助于我们进一步研究CD44在肿瘤细胞方面的其它调控机制,为其它恶性肿瘤细胞中高表达CD44基因提供潜在的应用价值。