目的:肾阳虚是由于肾阳衰微,命火不足而导致的一类虚寒症状,临床主要表现为腰膝酸软无力、性功能低下等,与现代医学慢性疲劳综合征、男性性功能障碍等疾病相关。中药肉苁蓉因具有补肾阳,益精血等功效,成为补肾壮阳的首选药物,在中国古代增力处方中被频繁使用。已有研究表明,肉苁蓉对下丘脑—垂体—靶腺轴的功能有调节作用,通过维持机体内环境稳态,改善疲劳状态,提高生殖能力。因此,本实验从与肾阳虚密切相关的疾病慢性疲劳综合症和男性性功能障碍入手,通过建立中枢和运动两种疲劳模型及大、小鼠生殖损伤模型,采用行为学观察与循环中相关激素水平检测相结合的方法,筛选列当科植物管花肉苁蓉(Citanache(Schenk)Wight)中寡糖(Oligosaccharides of Cistanche tubulosa,Oligose)、多糖(Polysaccharides of Cistanche tubulosa,Glycan)和苯乙醇总苷(Phenylethanol glycosides from Cistanche tubulosa,CPhGs)三个不同提取部位的药效活性。并进一步结合体内体外实验初步探究其主要活性部位促生殖补肾阳的潜在作用机制及治疗特点,为肉苁蓉物质基础的揭示及后续药物的开发提供实验依据。方法:1.管花肉苁蓉抗疲劳药效部位的筛选中枢性疲劳实验:将小鼠随机分为Control组、睡眠剥夺(Sleep deprivation,SD)组、Oligose组、Glycan组、CPhGs组。采用睡眠剥夺48h制备中枢性疲劳模型,随后采用八臂迷宫、避暗实验对小鼠的学习记忆能力进行检测,测定大脑皮层和下丘脑中5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)、肾上腺素(Epinephrine,E)及血浆促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin releasing hormone,CRH)、促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)、皮质醇(Cortisol,CORT)水平。运动性疲劳实验:将小鼠随机分为Control组、强迫游泳(Forced swimming,FS)组、Oligose组、Glycan组、CPhGs组。采用强迫游泳9 d制备运动性疲劳模型,随后进行负重游泳力竭实验评估小鼠运动能力,测定肝脏中肝糖原、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和骨骼肌中肌糖原、琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)以及血清乳酸(Lactic acid,LD)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、尿素氮(Bun urea nitrogen,BUN)、MDA 水平。综合以上方法对肉苁蓉抗疲劳作用进行药效部位的筛选。2.管花肉苁蓉促生殖药效部位的筛选为便于肾阳虚相关表征的采集,采用大鼠为实验对象。将大鼠随机分为Control组、Model组、Oligose组、Glycan组、CPhGs组。连续14 d注射氢化可的松制备生殖损伤模型,随后对肾阳虚相关表征进行观察,并测定大鼠勃起潜伏期,交配过程中捕捉/射精潜伏期和捕捉/射精次数。此外,测定性器官湿重及精浆中果糖和锌的含量,血浆环磷酸腺苷/环磷酸鸟苷(Cyclic adenosine monophosphate/cyclic guanosinc monophosphate,cAMP/cGMP)值,血清促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)、促卵泡生成素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、促黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)、雌二醇(Estradiol,E2)、睾酮(Testosterone,T)水平,采用苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察睾丸病理形态变化。综合以上方法对肉苁蓉促生殖作用进行药效部位的筛选。3.不同剂量的CPhGs促生殖作用的药效评价为节省药物用量以及考虑抗体种类的全面性,选用小鼠为实验对象。将小鼠随机分为 Control 组、Model组、阳性药丙酸睾酮(Testosterone propionate,TP)组、CPhGs-低剂量(CPhGs-1)组、CPhGs-中剂量(CPhGs-m)组、CPhGs-高剂量(CPhGs-h)组。连续14 d灌胃氢化可的松制备生殖损伤小鼠模型,测定小鼠勃起潜伏期,交配过程中捕捉/射精潜伏期和捕捉/射精次数,性器官湿重,血清LH和T水平,采用HE染色观察睾丸病理形态变化。分别从睾丸的形态结构以及小鼠生殖功能等多方面对CPhGs低、中、高三个剂量进行药效评价。4.CPhGs提高循环中T水平改善生殖能力的体内及体外机制研究通过蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)法检测睾丸组织中参与T合成的类固醇生成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR),细胞色素 P450 胆固醇侧链裂解酶(Cytochrome P450 cholesterol side chain cleavage enzyme,P450scc/CYP11A1)和 3β-羟基类固醇脱氢酶(β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)的表达。并通过免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色对3β-HSD进行定性与定量,进一步验证CPhGs对3β-HSD在睾丸中表达的促进作用。同时,在体外采用转染siRNA致CYP11A1低表达细胞模型,给予不同浓度CPhGs溶液(50,100,200μg/mL)干预,利用WB法测定CYP11A1水平,对CPhGs是否直接通过调控CYP11A1进而促进T生物合成的机制进行验证。结果:1.管花肉苁蓉抗疲劳药效部位的筛选肉苁蓉三个提取部位对疲劳小鼠的学习记忆和运动能力等行为学指标均有改善作用。其中Oligose可显著延长中枢性疲劳小鼠在避暗实验中的潜伏期,缩短完成八臂迷宫的时间,减少错误次数。使小鼠下丘脑及大脑皮层中5-HT,NE和E水平较SD组显著降低,血循环中CRH,ACTH和CORT接近正常水平。同时,Oligose可显著延长运动性疲劳小鼠的游泳力竭时间,减少代谢产物LD,BUN,MDA的堆积,增加小鼠肝糖原和肌糖原的储备。而Glycan只对运动性疲劳指标的改善效果显著,CPhGs无明显作用。因此,以上结果提示:Oligose改善小鼠中枢和运动性疲劳的效果最佳。2.管花肉苁蓉促生殖药效部位的筛选肉苁蓉三个提取部位对生殖损伤模型大鼠的性行为和血生化指标均有一定程度改善作用,但CPhGs的药效最为显著。具体表现为:CPhGs能使肾阳虚证特征之一的血浆cAMP/cGMP值恢复至正常水平,显著缩短大鼠的勃起和捕捉潜伏期,增加交配实验中捕捉次数,增加睾丸、精囊腺湿重及精浆中果糖和锌的含量,并使GnRH,FHS,LH和E2水平维持稳定,显著提高血清中T水平,改善睾丸的病理形态。而Glycan仅对FSH,LH和E2水平有调节作用,Oligose效果不甚明显。因此,以上结果显示:CPhGs改善大鼠生殖能力的作用最佳。3.不同剂量的CPhGs促生殖作用的药效评价中、高两个剂量(145、289mg/kg)的CPhGs对生殖损伤模型小鼠的性行为和血生化指标均有一定改善作用,低剂量的CPhGs(72mg/kg)无明显影响。而高剂量的CPhGs显著缩短了小鼠的勃起、捕捉和射精潜伏期,使捕捉和射精次数增加。同时,使小鼠睾丸、附睾、精囊腺和阴茎的湿重增加,T及其上游LH水平显著上调,睾丸病理形态得到明显改善。阳性药TP可显著改善生殖损伤模型小鼠的性行为,但使小鼠血液中T水平激增,远超正常水平,对LH水平并无明显作用,亦不能缓解对睾丸造成的病理损伤。以上结果提示:CPhGs可通过提高T水平进而改善小鼠生殖能力,并呈计量依赖性,高剂量效果最佳,且主要表现为对生殖损伤小鼠循环中T水平的适度升高,因而区别于阳性对照药TP的作用机制。4.CPhGs提高循环中T水平改善生殖能力的体内及体外机制研究体内实验WB结果显示:CPhGs可以显著提高睾丸组织中CYP11A1和3β-HSD的表达,但对转运蛋白StAR无明显作用,而TP抑制了 CYP11A1的表达。将IF进一步用于3β-HSD的定性和定量检测,结果与WB所示一致,高剂量CPhGs增加了3β-HSD的表达。体外实验WB结果显示:CPhGs(50μg/mL)可以显著提高正常细胞中CYP11A1的表达,转染siRNA致CYP11A1低表达再给予不同剂量的CPhGs干预后,CPhGs仍能显著提高CYP11A1的表达,但作用水平有所降低。以上结果表明:CPhGs可通过直接上调睾丸中T合成通路的关键酶CYP11A1的表达,进而促进其下游3β-HSD的表达,从而适度提高睾丸合成与分泌T的水平。结论:对管花肉苁蓉Oligose,Glycan以及CPhGs三个提取部位进行抗疲劳与促生殖的动物模型筛选与药效评价分析,得出:Oligose为肉苁蓉抗疲劳的主要药效部位;CPhGs是发挥促生殖作用的主要部位。其中,Oligose可通过调节中枢神经递质的释放,维持下丘脑—垂体—肾上腺轴相关激素水平的稳定,增强机体糖原储备能力,减少代谢产物堆积,进而改善疲劳小鼠的学习记忆及运动能力。CPhGs可保护睾丸免受氢化可的松损伤,增加睾丸及其副性器官的重量,维持下丘脑—垂体—性腺轴相关激素水平的稳定;并通过对T合成通路中CYP11A1的直接调控,提高胆固醇进入线粒体后合成T过程所经酶促反应中CYP11A1和3β-HSD的表达,促进T的分泌与释放,改善小鼠的生殖能力,发挥补肾阳作用。