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研究背景:早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)是一种可引起婴幼儿视力损害的致盲性眼病,增生的视网膜新生血管是其重要病理特征。除低出生孕周、低体重以及过度氧疗外,炎症在ROP的发生发展中也扮演着重要角色。小胶质细胞是视网膜组织中定居的单核巨噬细胞,主要参与免疫、炎症及损伤修复过程,并在视网膜血管的发育以及新生血管的形成中发挥着重要作用。本研究组前期研究证实,炎症能够激活小胶质细胞并促进视网膜新生血管的生成,但具体机制尚不明确。Caspase-1作为一种重要的蛋白水解酶,能够剪切、释放成熟的IL-1β、IL-18,是炎症信号通路中的核心分子之一。它在氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型视网膜组织中表达升高,可在体外参与小胶质细胞的活化,并可通过其下游分子参与小胶质细胞相关的视网膜新生血管性疾病的病理过程。但Caspase-1是否通过调控小胶质细胞,参与OIR中视网膜新生血管的生成,则有待于进一步研究。研究目的:探讨在小鼠OIR中,Caspase-1对小胶质细胞参与视网膜新生血管生成的调控作用及其可能的机制。研究方法:一、小鼠OIR动物模型相关研究:1.动物分组:7日龄(P7)新生小鼠随机分为常氧组、OIR组和OIR+VX-765组,常氧组在常氧环境中饲养,其余两组构建OIR模型;P12-P16,OIR+VX-765组和OIR组分别每天腹腔注射Caspase-1抑制剂VX-765和等量0.4%聚乙二醇(VX-765溶剂)。2.体重测量:在P12-P17,测量常氧组、OIR组和OIR+VX-765组小鼠的体重。3.免疫荧光染色:使用视网膜组织冰冻切片进行Caspase-1与Iba-1的免疫荧光染色,分别检测P12、P17的常氧组、OIR组小鼠视网膜组织中Caspase-1的表达和活化小胶质细胞的分布;并检测P17的常氧组、OIR组和OIR+VX-765组小鼠视网膜中小胶质细胞的活化情况。4.Western blot:P12、P17的常氧组、OIR组小鼠视网膜组织提取总蛋白,检测Caspase-1、p20、IL-1β、VEGF的表达水平;P17的常氧组、OIR组和OIR+VX-765组小鼠视网膜组织,提取蛋白后检测TLR4、NLRP3、Caspase-1、p20、IL-1β、TNF-α、VEGF的表达水平。5.视网膜铺片染色:分别于P12、P17制作全视网膜铺片行Lectin染色,观察验证OIR模型构建情况,并比较P17时常氧组、OIR组和OIR+VX-765组间视网膜无血管区以及新生血管面积的大小。二、培养小胶质细胞及血管内皮细胞相关研究:1.细胞分组:培养小胶质细胞系BV-2细胞分为对照组、缺氧组及抑制剂组,抑制剂组和缺氧组分别经VX-765和0.4%聚乙二醇预处理3h后,缺氧条件下培养24h;对照组常规条件下培养相同时间。常规培养血管内皮细胞系RF/6A细胞。2.Western blot:提取各组BV-2细胞总蛋白,检测Caspase-1、p20、TLR4、NLRP3、IL-1β、TNF-α、VEGF的表达水平。3.管腔形成实验:提取各组BV-2细胞培养上清液,作为条件培养基孵育RF/6A细胞,测量完整管腔形成长度。4.细胞迁移实验:提取各组BV-2细胞培养上清液,作为条件培养基孵育Transwell小室中培养的RF/6A细胞,计数迁移细胞数量。5.免疫荧光染色:对各组BV-2细胞进行Caspase-1和Iba-1免疫荧光染色,观察Caspase-1的表达以及小胶质细胞的活化情况。6.RT-PCR:提取各组BV-2细胞的总RNA,检测Iba-1的转录水平。7.ELISA:提取各组BV-2细胞培养上清液,检测IL-1β的蛋白浓度。研究结果:一、小鼠OIR动物模型相关研究:1.OIR模型构建:小鼠经氧诱导处理后,视网膜铺片结果显示,各时间点常氧组小鼠视网膜血管走行正常,均匀分布;P12,OIR组小鼠视网膜中央存在大片无血管区;P17,OIR组小鼠视网膜仍有无血管区,并有视网膜新生血管出现。提示,小鼠OIR模型构建成功。2.OIR小鼠视网膜组织中Caspase-1的表达、活化小胶质细胞的分布及相关分子的表达变化:免疫荧光结果显示,Caspase-1在常氧组小鼠视网膜组织中表达较弱,在OIR模型中表达增强,且P17强于P12,主要集中分布于神经节细胞层和内丛状层,并与活化小胶质细胞的分布有明确的共定位。Western blot结果显示,Caspase-1及其活性形式p20、IL-1β、VEGF在常氧组视网膜中表达量较低,在OIR模型中表达量显著增加(P12d<0.0001;P17d<0.0001);从变化趋势看,常氧组P17与P12间无明显差异(P>0.05),OIR组各蛋白的表达P17较P12明显增强(P<0.05)。3.Caspase-1对小鼠生长的影响:在P12-P17,OIR组小鼠体重明显低于常氧组(P<0.05),OIR+VX-765组小鼠体重显著低于常氧组(P<0.05),而OIR组小鼠体重与OIR+VX-765组之间没有明显差异(P>0.05)。4.Caspase-1对OIR小鼠视网膜无血管区及新生血管面积的影响:视网膜铺片Lectin染色结果显示,P17时常氧组小鼠视网膜血管化完全,分布均匀,形态规则,发育良好,未见明显无血管区及视网膜新生血管;OIR组视网膜无血管区和新生血管面积百分比分别为(16.58±1.14)%、(4.00±0.41)%;OIR+VX-765组两者均明显减少,分别为(12.23±1.02)%和(2.16±0.52)%(P<0.01)。5.Caspase-1对OIR小鼠视网膜小胶质细胞活化的影响:免疫荧光结果显示,P17时,常氧组小鼠视网膜中少见活化的小胶质细胞;OIR组中活化小胶质细胞明显增多,主要分布于神经节细胞层和内丛状层;OIR+VX-765组中活化的小胶质细胞较OIR组明显减少,只在神经节细胞层有少量分布。6.Caspase-1对OIR小鼠视网膜组织TLR4信号通路及VEGF表达的影响:Western blot结果显示,常氧组小鼠视网膜中TLR4、NLRP3、Caspase-1、p20、IL-1β、TNF-α和VEGF表达量低,OIR组表达均明显增高(P<0.05),OIR+VX-765组除了Caspase-1前体,其余分子表达均较OIR组明显下降(P<0.05)。二、培养小胶质细胞及血管内皮细胞相关研究:1.各组BV-2细胞中Caspase-1及其活性水平的表达变化:Western blot结果显示,对照组BV-2细胞中Caspase-1及其活化形式表达量较低,缺氧组两者表达明显增强(P<0.05),而抑制剂组Caspase-1变化不明显(P>0.05),其活性水平较缺氧组显著下降(P<0.05)。2.小胶质细胞条件培养基对血管内皮细胞RF/6A管腔形成的影响:正常对照组形成的管腔少,设定管腔形成相对长度为100,常规条件培养基组则为162±5,而经缺氧组BV-2培养液处理后明显增多,为271±12,加入Caspase-1抑制剂后又明显减少为171±22,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.小胶质细胞条件培养基对血管内皮细胞RF/6A迁移的影响:正常对照组的迁移细胞数量少,为112±22,条件培养基组增加为179±24,经缺氧组BV-2培养液处理后显著增加,为347±34,加入抑制剂后明显减少,为212±27,均存在显著差异(P<0.05)。4.缺氧条件下Caspase-1对培养小胶质细胞活性的影响:免疫荧光结果显示,对照组BV-2细胞Caspase-1、Iba-1信号弱,表达量少,缺氧组中两者表达明显增强(P<0.05),而抑制剂组中两者表达均显著下降(P<0.05)。RT-PCR结果显示,对照组BV-2细胞Iba-1表达低,缺氧后表达增强,而抑制剂处理后转录明显下调,统计学均有显著差异(P<0.05)。5.Caspase-1对缺氧条件下小胶质细胞分泌IL-1β的影响:ELISA结果显示,对照组BV-2细胞培养液中IL-1β蛋白浓度为(137±28)pg/ml,缺氧组中蛋白浓度显著升高,为(459±47)pg/ml,加入抑制剂后蛋白水平下降,为(302±39)pg/ml,均存在显著统计学差异(P<0.05)。6.Caspase-1对缺氧条件下小胶质细胞炎症和血管生成相关细胞因子表达的影响:Western blot结果显示,对照组BV-2细胞中TLR4、NLRP3、IL-1β、TNF-α、VEGF的表达水平较低,缺氧后各分子表达显著增强,加入抑制剂后各分子表达水平下降,差异均存在统计学意义(P<0.05)。结论:Caspase-1能够通过调控OIR小鼠模型小胶质细胞的活化,进而参与视网膜新生血管的生成,其作用机制可能与Caspase-1受TLR4信号激活,调控下游炎症效应分子IL-1β、TNF-α的表达,并释放VEGF相关。