1、研究背景和目的　　 食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一。中国，尤其是河南、河北和山西三省交界的太行山地区，是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区之一。明显的家族聚集现象是食管癌流行病学的突出特征之一。显著的地域性分布差异和明显的家族聚集现象提示环境和遗传因素在食管癌发生中可能起重要作用。近年的研究提示，遗传和环境因素交互作用可能是导致食管癌变的重要机制。但由于缺乏对人群大样本遗传变异检测的高通量技术，有关遗传变异和食管癌变关系尚不十分清楚。　　 2007年问世的全基因组关联分析(GenomeWideAssociationStudy,GWAS)技术很快被应用于恶性肿瘤等许多复杂性疾病易感基因的定位研究。并被认为是目前确定复杂性疾病遗传易感基因最有效的方法之一。GWAS技术的特点是高通量遗传变异检测（一次可检测50-100万个SNPs，SingleNucleitidePolymorphism）和强大的统计分析功能。　　 本课题组利用GWAS技术进行中国人群食管癌易感基因定位研究，发现C20orf54（又称核黄素转运基因，humanriboflavintransporter2，hFRT2）基因是食管癌重要的易感基因之一。hFRT2位于20号染色体，编码人核黄素转运蛋白2，细胞系和动物实验研究提示C20orf54的作用是将核黄素从细胞外转运入细胞内。老一代科学家对河南食管癌高发区的研究已证实核黄素缺乏是食管癌发生的重要危险因素之一。膳食补充核黄素能明显降低食管癌的患病风险。但是膳食补充核黄素所引起的干预效果存在明显的个体差异。C20orf54的变化可能在一定程度上解释了这种个体差异的分子基础。如果C20orf54基因变异，失去这种转运功能，即使补充核黄素也因为不能有效进入细胞内而失去干预的效果。很显然，进一步了解C20orf54基因的变化特征及其与核黄素水平关系，对揭示环境和遗传因素交互作用对食管癌变影响的分子基础和个体化防治等具有重要意义。　　 SNP是指在基因组水平上因单个核苷酸变异而引起的DNA序列多态性，是人类可遗传的变异中最常见的一种。位于基因编码区内的SNP(codingSNP，cSNP)较少，但它在与遗传有关疾病的研究中具有重大意义。本研究组食管癌GWAS研究确定C20orf54基因上一个重要SNP位点，这是一个重要的标签，提示该位点前后可能还存在其他与核黄素转运相关的变异位点。进一步对这一基因区域进行深度测序对阐明C20orf54基因不同变异类型具有重要意义。　　 需要指出的是，移民流行病学研究可能是揭示环境和遗传因素交互作用对食管癌发生影响的最佳模型之一。本研究组对河南食管癌高发区林州迁徙居民（＞100年）病理流行病学研究发现这些移民食管癌发病率与迁徙地居民相似。因此，对比分析这些迁徙居民与当地居民核黄素水平及C20orf54基因变异对进一步确立食管癌个体化防治新的研究思路和方向等具有重要意义。　　 本研究在前期工作基础上，通过检测长治地区正常人群、食管癌人群和长治林州移民血浆中核黄素水平及下常食管黏膜组织和鳞癌组织中核黄素水平，研究C20orf54基因中SNPs(rs3746804，rs3746803，rs3746802)与食管癌的遗传易感性，旨在揭示遗传与环境的相互作用关系，建立食管癌高危人群筛查的生物指标，为食管癌的个体化防治提供科学依据。　　 2、材料及方法　　 2.1、血清核黄素水平测定　　 2.1.1、研究对象和血样采集　　 研究对象分为三组:①对照组:选择2008年6月-2010年9月于长治医学院附属和平医院行胃镜检查并证实无食管、贲门和胃粘膜癌变的健康人群，共689例，其中男性530例（平均年龄:56.9±7.3岁），女性159例（平均年龄:58.1±5.8岁）:②食管癌组:经病理为食管鳞癌的患者，共445例，其中男性362例（平均年龄:57.3±5.9岁），女性83例（平均年龄:56.9±8.7岁），（所有患者均非林州移民或其后裔）;③林移组:居住于长治县林移村的河南省林州市健康移民人群，共347例，其中男性270例（平均年龄:55.6±9.3岁），女性77例（平均年龄:54.1±8.9岁）。　　 血样采集:上述人群均采集5ml空腹静脉血样，并于-40℃冰箱保存。　　 2.1.2、研究方法　　 提取人群血样DNA，采用酶联免疫吸附法，检测对照组、食管癌组和健康林移组人群血浆中核黄素水平。ELISA试剂盒（人维生素B2酶联免疫分析试剂盒）购自R&D公司。　　 2.2、组织核黄素水平测定　　 2.2.1、研究对象和组织收集　　 研究对象分为两组:①对照组:选择2010年9月-2011年2月于长治医学院附属和平医院行胃镜检查并证实无食管、贲门及胃粘膜病变的健康人群，共289例，其中男性177例（平均年龄:57.1±6.8岁），女性112例（平均年龄:58.1±7.9岁）;②食管癌组:选择2009年8月-2011年4月于长治医学院附属和平医院住院并经病理证实为食管鳞癌的患者，共250例，其中男性142例（平均年龄:58.3±5.2岁），女性108例（平均年龄:57.3±6.4岁）。　　 组织采集:为食管癌手术切除标本。①食管癌组:为肉眼观察坏死组织较少、黏膜尚完整的癌块组织;②对照组:癌组织5cm外、经病理切片证实无癌变的食管黏膜组织。所有标本以锐刀切取，包括食管全层:黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层，于-80℃冰箱保存。　　 2.2.2、研究方法　　 将组织标本从-80℃冰箱中取出，电子天平上称取各标本100mg（包括对照组和食管癌组），加10mMPBS溶液1mL，组织匀浆仪充分匀浆后，将匀浆倒入离心管中离心20min，2000r/min，取上清200μL备用。采用酶联免疫吸附法(ELISA)，按照HumanVB2ELISAKit试剂盒操作步骤检测各组组织中核黄素水平。　　 2.3、C20orf54基因中三个SNP位点与食管癌遗传易感性　　 2.3.1、研究对象及血样采集　　 研究对象分为两组:①对照组:选择2008年6月-2010年9月于长治医学院附属和平医院行胃镜检查并证实无食管、贲门及胃粘膜癌变的健康人群，共198例，其中男性130例（平均年龄:57.4±5.3岁），女性68例（平均年龄:56.9±6.1岁）;②食管组:经病理证实为食管鳞癌的患者，共240例，其中男性159例（平均年龄:57.9±7.6岁），女性81例（平均年龄:58.5±9.1岁）。病例资料内容详细包括性别、年龄、吸烟史、血型、体质指数、抽烟饮酒史和家族史。　　 血样采集:上述人群均采集5ml空腹静脉血样，-40℃冰箱保存。　　 2.3.2、研究方法　　 从分子水平上探讨“C20orf54基因型→核黄素水平（血浆及组织）→食管黏膜病变（正常黏膜、癌前病变）→食管癌发生”的关系，发现与食管癌变相关的错义cSNP位点。　　 C20orf54基因共有9个错义cSNP位点(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?geneId=113278)，我们对其中7个SNP位点的初步实验结果显示:食管癌患者中有3个位点检测存在SNP错义(mRNApos1139、1172、1246)，以1139和1172位点出现的频率最高。　　 采用Promega公司的Maxwell(R)16System及试剂盒提取全血中基因组DNA。以提取出来的全基因组DNA为模板，扩增C20orf54基因的3号外显子(含有三个cSNP位点-mRNAPOS，1139，1172，1246)，由上海生工生物有限公司合成引物如下:　　 上游5GGAGTTCCCAGAGCTTTGGTGTCCG3　　 下游5CATAGGACAGGCAGGAGTAGGT3　　 PCR扩增3号外显子，PCR扩增产物由北京华大基因完成测序，分析测序结果，找出三个cSNP位点，计算突变频率。　　 2.4、统计分析　　 使用SPSS18.0软件进行统计分析。数值以平均值±标准差（(x)±s）表示，三组间差异比较采用方差分析，三组间两两比较采用Bonfferoni法。应用免费在线软件检查各个人群基因型分布是否符合哈迪温伯格平衡(http://www.kursus.kvl.dk/shares/vetgen/_Popgen/genetik/applets/kitest.htm)，应用Logistic回归检验各基因型以及不同组合对食管癌的患病风险的影响（OR值以及其95％可信区间）。P＜0.05认为差异有统计学意义。　　 3、结果　　 3.1、血清核黄素水平测定　　 3.1.1、三组年龄、性别构成比较　　 食管癌组病例445例，男、女所占比例分别为81.35％和18.65％;≥50岁和＜50岁的男性患者所占比例分别为57.75％和23.60％，≥50岁和＜50岁的女性患者所占比例分别为10.56％和8.09％。对照组人群689例，男女构成比分别为76.92％和23.08％;≥50岁和＜50岁的男性患者所占比例分别为49.20％和27.72％，≥50岁和＜50岁的女性患者所占比例分别为16.40％和6.68％。林州移民组347例，男、女构成比分别为77.81％和22.19％;≥50岁和＜50岁的男性患者所占比例分别为51.30％和26.51％，≥50岁和＜50岁的女性患者所占比例分别为9.51％和12.68％。三组人群在年龄、性别构成上无统计学差异(P＞0.05)。　　 3.1.2、三组核黄素水平比较　　 食管癌组血清中核黄素水平显著低于对照组(731.69±330.67ug/Lvs1090.43±445.08ug/L，P＜0.05)和林移组（731.69±330.67ug/Lvs897.58±177.78ug/L，P＜0.05）;而对照组血浆中核黄素水平(1090.43±445.08ug/L)高于林移组(897.58±177.78ug/L)(P＜0.05)。　　 3.2、组织核黄素水平测定　　 3.2.1、两组年龄、性别构成　　 食管癌组:共250例，男、女构成比例分别为56.8％和43.2％;≥50岁和＜50岁患者比例分别为76.4％和23.6％;男性患者中，≥50岁和＜50岁的患者比例分别为42.4％和14.4％;女性患者中，≥50岁和＜50岁的患者比例分别为34.0％和9.2％。　　 对照组:共289例，男、女构成比分别为61.2％和38.8％;≥50岁和＜50岁的健康体检者所占比例分别为69.6％和30.4％;在男性人群中，≥50岁和＜50岁人群所占比例分别为43.6％和17.6％;在女性人群中，≥50岁和＜50岁人群所占比例分别为26.0％和12.8％。　　 3.2.2、两组核黄素水平比较　　 食管癌组患者血浆中核黄素水平显著低于对照组人群(753.46±624.56vs1097.63±808.12)，差异有统计学意义(P＜0.05);食管癌组织中核黄素含量低于边缘正常对照组织含量(17.45±3.43vs22.06±3.21)，差异有统计学意义(P＜0.001)。　　 3.3、C20orf54基因中三个cSNP位点与食管癌遗传易感性的研究　　 3.3.1、两组性别、年龄、吸烟人数、饮酒、家族史、血型及BMI构成　　 食管癌组和对照组在性别、年龄与吸烟人数构成等方面无差异。饮酒者和有UGIC家族史者在ESCC中的比例（分别为:46.7％和27.5％）明显高于对照组（分别为:37.2％和18.2％），因此饮酒和UGIC家族史可显著增加人群ESCC的发病风险(P=0.045和P=0.014)，经性别、年龄状况校正后的OR值分别为1.78(95％CI=1.12-2.83)和1.75(95％CI=1.10-2.79);不同血型的人群在食管癌组与对照组分布不同(P=0.021)，B血型人群ESCC的发病风险显著低于A型血型人群，经性别、年龄状况校正后的OR值为0.52(95％CI=0.31-0.87);不同BMI指数的人群在食管癌组与对照组分布亦不同(P=0.000)，相对于BMI＞24的人群，BMI＜18.5和BMI为18.5-24之间的人群显著增加A型血型人群ESCC的发病风险，经性别、年龄状况校正后的OR值分别为4.52(95％CI=2.34-8.72)和2.70(95％CI=1.67-4.37)。　　 3.3.2、C20orf54基因rs3746804、rs3746803、rs3746802位点多态性分析　　 3.3.2.1、C20orf54基因rs3746804(1139C＞T)位点多态性分析　　 C20orf54基因rs3746804位点基因型的频率在食管癌组和对照组中分布符合Handy-Weinberg平衡(x2=2.58，P=0.108)。在食管癌患者和对照组中C/C、C/T和T/T各基因型的频率差异具有统计学显著性(x2=8.06，P=0.018)。在调整了年龄、性别等因素后，携带C/T基因型的个体较C/C携带者罹患食管癌的风险显著降低(校正OR=0.58，95％CI:0.38-0.88)。　　 对吸烟、饮酒、家族史、血型和体质指数等因素分层后进行条件logistic回归分析，结果显示，ESCC组和对照组中吸烟者的基因型频率分布有显著差异。与C/C相比，C/T基因型不但可以显著降低吸烟组ESCC的发病风险（经性别和年龄校正后的OR=0.37，95％CI:0.20-0.68），而且显著降低饮酒组ESCC的发病风险（经性别和年龄校正后的OR=0.31，95％CI:0.15-0.64）。同时，ESCC组和对照组中无UGIC家族史的人群基因型频率分布亦有显著性差异（经性别和年龄校正后的OR=0.48，95％CI:0.30-0.78）。在BMI为18.5-24的组中，ESCC患者组和对照组基因型频率分布有显著性差异。与C/C相比，C/T基因型也可显著降低吸烟组ESCC的发病风险(经性别和年龄校正后的OR=0.56，95％CI:0.32-0.96)。　　 3.3.2.2、C20orf54基因rs3746803(1172C＞T)位点多态性分析　　 食管癌组和对照组中C/C、C/T和T/T基因型的频率分布差异具有统计学意义(x2=13.10，P=0.001)。在调整了年龄、性别等因素后，携带C/T基因型和T/T基因型的个体较C/C携带者罹患食管癌的风险显著降低（校正OR=0.66，95％CI:0.41-1.05）。　　 对吸烟、饮酒、家族史、血型和体质指数等因素分层后进行条件logistic回归分析，结果显示在不吸烟组中，与C/C相比，C/T和T/T基因型显著降低食管癌发生率（经年龄和性别校正后OR=0.47，95％CI:0.23-0.97），在无UGIC家族史的人群中，C/T和T/T基因型亦显著降低食管癌发生风险(经年龄和性别校正后的OR=0.57，95％CI:0.34-0.98)。然而，在有UGIC家族史的人群中，与C/C相比，C/T和T/T基因型增加食管癌发病风险，但差异无统计学意义，在O型血人群中，C/T和T/T基因型亦显著增加食管癌发生的风险性(经年龄和性别校正后OR=0.30和0.47，95％CI:0.22-0.99)。　　 3.3.2.3、C20orf54基因rs3746802(1246A＞G)位点多态性分析　　 食管癌组和对照组中C/C、C/T和T/T各基因型的频率差异具有统计学显著性（x2=7.97，P=0.019）。在调整了年龄、性别等因素后，携带A/G基因型和G/G基因型的个体较A/A携带者罹患食管癌的风险显著降低（校正OR=0.53，95％CI:0.34-0.84）。　　 对吸烟、饮酒、家族史、血型和体质指数等因素分层后进行条件logistic回归分析，结果显在不吸烟组中，与A/A相比，A/G和G/G基因型显著降级食管癌发生率（经年龄和性别校正后OR=0.46，95％CI:0.23-0.92）。在喝酒人群中，与A/A相比，A/G和G/G基因型显著降级食管癌发生率(经年龄和性别校正后OR=0.39，95％CI:0.19-0.82)。在无UGIC家族史的人群中，与A/A相比，A/G和G/G基因型显著降级食管癌发生率(经年龄和性别校正后OR=0.55，95％CI:0.33-0.92)。　　 4、结论　　 4.1、对照组血清核黄素水平高于林州组，而林州组高于食管组。表明，食管癌患者血浆中存在核黄素缺乏现象。　　 4.2、食管癌组织中核黄素水平显著低于对照组组织中核黄素水平(17.45±3.43vs22.06±3.21，P＜0.001)，提示核黄素缺乏与食管癌发生相关。　　 4.3、C20orf54基因中三个错义SNP位点rs3746804、rs3746803、rs3746802可能与食管癌易感性有关。