背景:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的主要慢性微血管并发症之一,是全球发达国家透析的首要原因,也是我国肾脏病患者透析的主要原因。随着我国老龄化的加速,饮食结构和生活方式的显著变化,DM的患病率显著升高(10.9%),其中1/3的1型糖尿病(Type]diabetes mellitus,T1DM)患者和 20%的 2 型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)可并发DN。DN典型特征是肾小球肥大、蛋白尿、肾小球滤过率进行性降低及肾脏纤维化,进而导致肾功能丧失;肾小球内高压和高滤过是由糖代谢异常、血流动力学、遗传易感性等异常引起的,然而,导致DN的具体分子机制尚不完全清楚。由于存在复杂的代谢疾病背景,DN 比其它肾脏疾病的预防和治疗更具有挑战性,DN已成为我国重要的科学和社会问题。自噬(Autophagy)在机体肾脏正常和疾病状况的许多方面起关键调节保护作用,某些疾病状态下肾脏自噬活性变化,而自噬活性的变化也影响肾脏病的进展。在T2DM患者肾活检组织以及T2DM大鼠模型的肾脏组织中均可以检测到自噬相降解底物蛋白p62的增加,表明在DN中肾脏自噬活性受到抑制。在能量过剩的情况下,如高浓度的葡萄糖、氨基酸和胰岛素可有效激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target of Rapamycin,mTOR),抑制细胞自噬;相反,在能量缺乏的情况下,细胞内腺嘌呤核糖核苷酸(Adenosine monophosphate,AMP)和烟醜胺腺嘌呤二核苷(Nicotinamide adenine dinucleoside,NAD+)水平的增加而有效激活AMPK和沉默信息调节因子1(Silent information regulator of transcription 1,SIRT1),从而诱导自噬。二甲双胍(metformin,MET)是临床T2DM首选的口服降糖药物。近年来的研究发现MET除了降血糖作用外,在多囊卵巢综合征、肿瘤、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、衰老和青春期早熟等诸多方面显示出显著疗效且对DN有保护作用,但对其降低血糖以外的作用和保护肾脏的分子机制仍不十分清楚。SIRT1主要表达于内髓质和肾间质,在人以及DN动物模型中,SIRT1的表达和活性均降低,SIRT1的激活可以保护肾脏免受高血糖损伤。沉默SIRT1能抑制白藜芦醇(resveratrol,RES)和营养剥夺对人肿瘤细胞自噬的诱导,而过表达SIRT1则能促进这些细胞的自噬。SIRT1可以通过其对一系列转录因子的去乙酰化来促进或增强自噬机制组成分子的表达,从而激活自噬水平,其中最突出的是叉头框蛋白家族(forkhead box Transcription factor ofthe O class,FOXO)的成员。体外培养的心肌细胞在无葡萄糖培养基中能够通过SIRT1和(forkhead box Transcription factor Ol,FOXO1)依赖的方式诱导细胞自噬,FOXOl促进晚期自噬体溶酶体融合的Ras相关小 GTP 酶结合蛋白 7(Ras-related GTP-binding protein 7,Rab7)的表达,Rab7表达水平增加能够促进FOXO1诱导的自噬活性增加,而其沉默后可抑制FOXO1诱导的自噬。综上,我们推测在DN中MET可能通过调控SIRT1/FOXO1自噬途径促进自噬,减轻肾损伤。在本研究中我们采用高脂饲喂和STZ联合处理建立T2DM大鼠模型,观察MET是否经过调控自噬,发挥肾脏保护作用。进一步研究在系膜细胞上进行观察了 MET在高糖诱导的RMC增殖、炎症和ECM积累中的作用,明确了 MET通过对调控SIRT1/FOXO1介导的自噬保护肾脏的潜在机制,为DN的发生发展和MET保护肾脏的分子机制提供了新见解。第一部分二甲双胍通过诱导SIRT1/FOX01介导的自噬减轻糖尿病大鼠肾损伤目的:MET是T2DM首选的一线降糖药物。近期的研究显示除了降血糖外,MET还能够抑制DN患者肾组织中内质网应激、上皮-间质转化和氧化应激,促进缺氧诱导因子(HIF)的表达和自噬具有保护肾功能的作用,但其分子机制尚不明确。本研究使用高脂喂养结合腹腔注射STZ建立大鼠糖尿病模型,并使用MET进行治疗,观察MET是否通过自噬途径减轻大鼠肾脏损伤。方法:1)为观察MET对糖尿病肾脏的保护作用,将50只SD大鼠,分成5组,常规饲料饲养的对照组(NC组),高脂饲料喂养联合空腹状态下按照30mg/kg体重腹腔注射STZ造模成功的DM组(DM组),DM低剂量MET治疗组(MET150组)、DM中剂量MET治疗组(MET300组)、DM高剂量MET治疗组(MET500组),MET150、MET300、MET500 组分别予以 MET150、300、500mg/kg.d 灌胃治疗,持续8周。2)为观察SIRT1/FOXO1介导的自噬在MET治疗中的作用,另将40只SD大鼠随机分成4组,常规饲料喂养的对照组(NC组),高脂饲料喂养联合STZ腹腔注射制作的DM组(DM组),DM+高剂量的MET干预组(MET组),DM+MET+SIRT1抑制剂EX527干预组(EX527组),MET组大鼠予以MET 500mg/kg.d灌胃治疗,EX527组大鼠予以MET 500mg/kg.d灌胃治疗同时予以5mg/kg.d腹腔注射EX527干预,持续8周。8周后收集尿标本在检测UA1b、Ucr,计算尿白蛋白/尿肌酐比。将各组大鼠麻醉后取血和双肾组织,取部分右肾皮质组织4%甲醛固定制备组织切片用于HE、Masson和TUNEL染色;取部分右肾皮质用4%戊二醛固定后进行电镜观察。左肾部分组织用于提取蛋白,进行Western blot和生化检测。血用于检测血中BUN与Scr水平。结果:MET 治疗 8 周后,MET150、MET300、和 MET500 组大鼠 BG、Scr、BUN和UACR与DM组相比均显著下降(P<0.01);肾组织SOD表达水平增加(P<0.01),MDA表达水平下降(P<0.01);且MET作用具有剂量依赖性。HE和Masson染色结果显示MET能够显著减轻肾小管损伤(P<0.01)和肾组织胶原堆积(P<0.01);TUNEL染色结果表明MET能够明显减少DM大鼠肾组织细胞凋亡比例(P<0.01)。电镜结果表明MET能够显著降低DM大鼠肾小球基底膜厚度,减少足突融合(P<0.01)。Western blot分析显示在DM大鼠肾组织中SIRT1和FOXO1表达水平下降,高剂量MET能够显著上调SIRT1和FOXO1的表达,使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加,促进Beclin-1表达,抑制p62表达,促进自噬,显著抑制Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)、ⅣV型胶原蛋白(collagen ⅣV)和纤连蛋白(fibronectin,FN)的表达。MET治疗同时使用SIRT1抑制剂EX527干预处理,大鼠BG、Scr、BUN、UACR以及肾组织中SOD和MDA水平与DM组相比无显著变化;EX527能够抑制MET对DM大鼠肾小管损伤评分、肾组织胶原容积分数和细胞凋亡比例的改善作用;Western blot结果显示EX527能够抑制MET上调SIRT1和FOXO1表达的作用,使得LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降,抑制Beclin-1表达,促进p62表达,抑制自噬,显著促进collagen Ⅰ、collagen ⅣV和FN的表达。结论:本研究的结果显示MET能够通过上调肾组织自噬,保护肾功能,减轻肾组织氧化应激和肾小球病理和结构改变,抑制细胞外基质表达。EX527能够阻断MET对大鼠肾脏的保护作用,提示MET通过诱导SIRT1/FOXO1介导的自噬减轻T2MD大鼠肾损伤。第二部分二甲双胍通过SIRT1/FOX01介导的自噬抑制高糖培养的系膜细胞增殖、炎症和细胞外基质表达目的:作为T2DM的首选降糖药物,目前MET对大鼠系膜细胞(rat mesangial cells,RMC)的影响及分子机制还不完全了解。本研究探讨了 MET对高糖诱导的RMC增殖,炎症反应和细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)积累的影响,并进一步分析了 SIRT1/FOXO1介导的自噬在其中的作用,以期能够发现MET治疗DN提供基础理论依据。方法:1)为观察MET对高糖培养的RMC的影响,我们将RMC随机分为6组:正常糖组(5.5mmol/L glucose,NG组)、高糖组(30mmol/L glucose,HG组)、高甘露醇组(5.6mmol/L glucose+24.4 mmol/L mannitol,HM组)、高糖+10 μmol/L MET(MET-10组)、高糖+50 μmol/L MET(MET-50组)和高糖+100 μmol/L MET(MET-100组);2)为观察自噬在MET处理高糖培养的RMC中的影响,我们将RMC随机分为4组:正常糖组(5.5mmol/L glucose,NG组)、高糖组(30mmol/LL glucose,HG组)、高糖+50 μmol/LMET(MET组)和高糖+50 μmol/L MET+10mmol/L3-MA(MET+3-MA组);3)为观察SIRT1/FOXO1 在MET处理高糖培养RMC自噬改变中的作用,我们将RMC随机分为三组:高糖+MET+siRNA对照组(si-Ctrl)、高糖+M ET+SIRT siRNA组(si-SIRT1)和高糖+MET+FOXO1 siRNA组(si-FOXO1);通过MMT检测MET对高糖培养的RMC细胞的增殖能力变化;通过ELISA检测MET对高糖培养后RMC细胞培养上清中TNF-α IL-6和TGF-β1的含量;通过Western blot检测MET对高糖培养的RMC细胞中FN、collagenⅣ、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、SIRT1 和FOXO1 的表达水平,分析LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值;通过荧光显微镜观察MET对高糖培养的RMC细胞中自噬小体数目的影响。结果:在高糖培养的RMC细胞中,使用50或100μmol/L的MET处理可以使细胞的增殖能力下降2倍以上。ELISA结果显示50或1OOμmol/L的MET处理显着降低了高糖刺激的TNF-α,IL-6和TGF-β1的表达。同样的,MET处理组细胞与高糖培养的细胞相比,collagen ⅣV和fibronectin的表达显着减少。50μmol/L和100μmol/L MET 处理比 10μmol/L MET 更有效,而 50μmol/L 和 100μmol/L MET处理直接无显著性差异。通过荧光显微镜观察噬小体,发现与仅用高糖处理的RMC相比,MET预处理后的RMC中绿色荧光斑点的数量显著增加。Western blot检测的结果显示MET处理能够显著提高高糖诱导的RMC中Beclin-1的表达水平以及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的比值。在MET处理的细胞中同时加入3-MA,与仅使用MET组相比,MTT结果表明在有3-MA的情况下,细胞增殖能力显著增加;ELISA结果表明3-MA处理后,细胞培养上清中TNFα、IL-6和TGFβ水平显著升高,fibronectin和collagen Ⅳ的表达水平明显增加。为了确定MET激活自噬的分子机制,采用Western blot法检测SIRT1和FOXO1蛋白的表达以及FOXO1乙酰化水平。与正常细胞相比,高糖显著抑制SIRT1和FOXO1蛋白的表达,但MET能够上调SIRT1和FOXO1蛋白表达水平以及下调FOXO1乙酰化水平。转染针对SIRT1和FOXO1的小干扰RNA,均能够抵消MET抑制RMC增殖的作用;显著增加TNF-α、IL-6和TGF-β的表达;减少RMC中自噬小体的数量,显著下调Beclin-1的表达水平以及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的比值,但上调了 fibronectin和collagenⅣ的表达。结论:体外研究结果显示MET可通过SIRT1/FOXO1介导的自噬抑制高糖诱导的RMC增殖、炎症反应和细胞外基质表达。SIRT1/FOXO1介导的自噬改变是MET治疗DN的潜在靶点。