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目的:目前治疗疼痛最常用的方法是阿片类镇痛药物。但是有诸多的副作用,如引起过度镇静、呼吸抑制、便秘以及成瘾等。寻找更方便、有效、作用持久且经济、安全的镇痛方法,成为人们关注的课题。内源性阿片肽自发现以来,其镇痛效果好,副作用小,无成瘾性等优点日益受到关注,在前期试验中我们将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因与真核表达载体pcDNA3.1（+）连接,构建重组质粒pcDNA3.1（+）-EGFP,鞘内直接注射入大鼠的蛛网膜下腔,能被蛛网膜下腔上皮细胞摄取并表达长至六周,提示如果质粒携带镇痛基因鞘内注射可能起到镇痛作用并在体内表达较长时间（一月以上）。为进一步研究真核质粒携带的脑啡肽基因表达部位与表达时效,本实验将PENK与荧光真核表达载体连接,构建重组质粒pEGFP-C3—PENK,并将其转入NIH3T3细胞中使其表达脑啡肽,观察其表达的部位与时间,并将阳性克隆细胞与细胞神经元细胞共同培养,使合成的脑啡肽与神经细胞表面的受体结合激活细胞信号通路,通过对神经元细胞内磷酸激酶A活化量的变化检测,证明合成的脑啡肽有生物活性。方法1.RT-PCR根据GenBank报道的人前脑啡肽原基因序列（NM006211）,使用Primer5.0设计引物,内侧引物的5′与3′端加上相应酶切位点,整合入载体。提取人脑组织总RNA。反转录得到人前脑啡肽原基因的单链cDNA,PCR扩增反转录产物。2.真核表达载体的构建将测序正确的片段,双酶切,同相应双酶切的pEGFP-C3载体大片段连接,转化E.coli JM109菌株,Kana筛选,挑选阳性菌落,提取质粒,双酶切鉴定。3.细胞的转染及阳性克隆筛选先确定G418的致死剂量,用脂质体2000进行转染。转染24小时后用荧光显微镜观察绿色荧光载体转染情况,并用含600mg/L G418的完全DMEM选择培养基筛选十天,4.阳性克隆细胞免疫组化及上清液中脑啡肽含量的测定。待有绿色荧光的细胞接近完全汇合后收集细胞上清,即含有脑啡肽的培养液,通过放免测定上清液中脑啡肽含量。将筛选后的阳性克隆细胞做以L-ENK为一抗的细胞红色荧光免疫组化检测,结合细胞内绿色荧光蛋白的表达,观察pEGFP-C3-PENK质粒在细胞内合成绿色荧光与人前脑啡肽结合蛋白的部位及L-ENK分泌情况。5.原代神经细胞的培养及分组取新生大鼠的皮质神经元细胞。以106/ml的密度种植到250ml的细胞培养瓶中,置37℃,5%CO2培养箱中培养一周。分成对照;前列腺素（PG）刺激;加入脑啡肽的PG刺激;纳洛酮预孵育后加入脑啡肽的PG刺激四组。6.Western blotting测定各组神经元细胞中磷酸化PKA的量。将提取的各组神经元细胞总蛋白做蛋白含量曲线测定,并根据总蛋白的量上样做Western blotting测定各组神经元细胞中PKA磷酸化的量。结果1.提取人脑组织总RNA,反转录得到单链cDNA,套式PCR扩增反转录产物,得到800bp左右的片段,双酶切后同相应双酶切的载体大片段连接,构建重组绿色荧光载体质粒pEGFP-C3-PENK。2.细胞免疫组化显示,转染pEGFP-C3-PENK质粒的阳性细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光,在细胞周围特别是细胞膜上显示大量的红色荧光,提示在细胞内合成绿色荧光与人前脑啡肽结合蛋白,人前脑啡肽经酶裂解后产生L-ENK穿细胞膜分布在细胞上清内。3.放免法测定pEGFP-C3-PENK阳性转染克隆的NIH3T3细胞上清液中L-ENK的含量为903.53+82.83pg/ml。4.Western blotting显示,转染pEGFP-C3-PENK质粒的细胞分泌的脑啡肽可使神经原细胞PKA活化量减少,加入纳洛酮可拮抗脑啡肽的作用。结论1.人前脑啡肽原基因的绿色荧光蛋白真核表达载体转染入NIH3T3细胞中,并能长期（超过一个月）表达。2.新合成的脑啡肽可以抑制神经细胞PKA系统的活化,其抑制作用可被纳洛酮拮抗。