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日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的急性和慢性疾病,它引起肝纤维化主要致病的机理是,虫卵沉积导致肝脏虫卵肉芽肿以及继发性的肝纤维化形成。由于宿主对虫卵抗原持续产生免疫应答反应,使静止期的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)被异常激活,HSCs开始增殖,转变成为肌成纤维细胞,并表达α-平滑肌动蛋白以及分泌细胞外基质(extracellularmatrix,ECM),过量的ECM无法被降解,沉积在肝脏内,导致了肝纤维化的发生。近年来,不具备编码蛋白功能的lncRNA逐渐被人们认识,在众多肿瘤中表达异常,参与了细胞增殖、活化以及凋亡等多种生物学进程的调控。最近一些肝纤维化的研究发现,lncRNA可以通过调节HSCs的激活,来影响肝纤维化的发生、发展。目前,人们对lncRNA-p21、GAS5、MALAT1、PVT1、lncRNA-H19在肝纤维化中的调控作用,研究的比较多。但这些lncRNA在日本血吸虫感染宿主,致肝纤维化过程中的作用机制尚未阐明。课题组前期的研究发现,ICOS信号的下调,可以一定程度缓解肝纤维化和减轻HSCs的活化。在本课题的研究中,应用了 ICOSL-KO小鼠及其野生型对照C57BL/6J小鼠,建立日本血吸虫病动物模型,探索ICOSL/ICOS信号在肝纤维化进程中对lncRNA的调控作用以及lncRNA对HSCs活化的影响,寻找抑制HSCs活化和治疗肝纤维化疾病的新途径。本课题研究分为四个部分:第一部分日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离鉴定及培养目的:提取纯度较高的小鼠原代HSCs,在体外培养7天,用来模拟HSCs在小鼠体内活化的状态,为后续实验奠定基础。方法:(1)挑取5♂+7♀条日本血吸虫尾蚴分别感染ICOS-KO小鼠,和野生型对照C57/BL6J小鼠,来建立日本血吸虫性肝纤维化模型。使用原位肝脏酶灌注的方法和通过密度梯度离心来获取,未感染、感染后4周、7周、9周、12周五个不同病期小鼠体内的原代HSCs,其中7周是感染急性病变期,12周是感染晚期。通过台盼蓝染色法鉴定原代HSCs的存活率。(2)活细胞工作站观察拍摄,在波长为328nm的紫外激发光下,HSCs自发的蓝绿色荧光并计数,鉴定细胞的纯度。(3)对HSCs进行GFAP免疫荧光染色,在荧光显微镜下观察计数,鉴定细胞的纯度。结果:(1)新鲜提取的小鼠原代细胞在培养的过程中,生长状态良好,活化变形明显。每只小鼠所获取到的细胞数量平均为(1.95±0.2)x 106个/鼠,存活率能达到90%以上。(2)在活细胞工作站下,能够观察到新鲜分离的细胞培养过夜后,在328nm的紫外激发光下自发的蓝绿色荧光。(3)将HSCs培养3天后,进行GFAP免疫荧光染色,在荧光显微镜下,观察到胞浆中的红色荧光,通过计数得出细胞的纯度为90%以上。结论:日本血吸虫感染小鼠建立的实验动物模型,所获取原代HSCs的存活率及纯度都在90%以上,符合了后续实验的要求。第二部分日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中肝组织免疫病理及HSCs相关lncRNA的动态表达目的:检测在日本血吸虫尾蚴感染C57BL/6J小鼠慢性致病的过程中肝脏免疫病理及相关lncRNA的动态表达。方法:(1)对肝脏组织切片进行HE染色,在显微镜下观察比较,不同感染病期小鼠的肝脏虫卵肉芽肿面积。(2)分离未感染、感染后4周、7周、9周、12周的原代HSCs,在培养7d后,TRIzol Reagent抽提总RNA,应用实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,Real-time PCR)法检测 C57BL/6J 小鼠原代 HSCs 中lncRNA-P21、lncRNA-H19、lncRNA-GAS5、lncRNA-MALAT1、lncRNA-PVT1 的表达水平,分析比较各个基因在血吸虫病过程中的动态表达。结果:(1)HE染色的结果:在未经日本血吸虫感染的小鼠肝脏组织切片中,观察到肝小叶结构完好,肝细胞的形态良好,未出现损伤;而感染后的小鼠肝脏组织切片,肝小叶的正常结构被破坏,炎性细胞浸润在虫卵周围形成肉芽肿,并且伴随着纤维化的发生,随着感染周期的增加,肉芽肿的面积在感染7周(12.1±0.92)x 104um2时最大,在9周、12周面积缩小,而胶原的沉积逐渐增加。(2)日本血吸虫在感染C57BL/6J小鼠后,随着肝脏纤维化的发生、发展,lncRNA-PVT1、lncRNA-GAS5在HSCs中表达,自感染4周后lncRNA的表达开始上升,感染 7 周(PVT1,5.184±0.7346,gene/GAPDH,P<0.01;GAS5,5.849±0.2907,gene/GAPDH,P<0.0001)后表达达到了峰值,而在感染后9周、12周表达持续下降。lncRNA-H19的表达自感染后4周显著升高,但在感染后7周、9周、12周表达逐渐下降。lncRNA-P21的表达在4周开始显著下调,到7周、9周后有所回调,12周表达继续下调低于未感染组。lncRNA-MALAT1的表达从感染4周后开始上升,到7周(6.666±0.08177,gene/GAPDH,P<0.0001)达到峰值,9周略微下降,仍保持在较高水平,12周后显著下调。结论:在日本血吸虫的致病过程中,HSCs是持续呈活化状态,lncRNA-P21、lncRNA-H19在HSCs的表达较低,lncRNA-P21的表达随着肝纤维化程度的加重,表达均呈现下调的趋势;lncRNA-H19的分子表达在感染后7周,随着纤维化程度加重而逐渐下调。lncRNA-PVT1、lncRNA-GAS5、lncRNA-MALAT1 的表达水平比较高,随着纤维化程度的加重而上调,研究结果提示上述lncRNA可能作为潜在的靶点调控肝纤维化的进程。第三部分共刺激信号ICOSL/ICOS对日本血吸虫感染小鼠的免疫病理形成及HSCs相关lncRNA动态表达的影响目的:ICOS-KO小鼠建立日本血吸虫模型,探讨下调共刺激信号对肝脏病理变化及对相关lncRNA表达的影响。方法:(1)采用HE染色的检测方法,处理ICOSL-KO小鼠和野生型C57BL/6J小鼠,五个感染周期的肝脏标本。(2)收集五个感染周期的原代HSCs,在体外培养7d后,通过TRIzol Reagent抽提细胞总RNA,再逆转录成cDNA,实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,Real-time PCR)分别检测ICOS-KO 小鼠和 C57BL/6J 小鼠的原代HSCs 中 lncRNA-P21、lncRNA-H19、lncRNA-GAS5、lncRNA-MALAT1、lncRNA-PVT1的表达水平,分析比较它们的表达变化。结果:ICOS-KO 小鼠原代 HSCs 中,检测到 lncRNA-P21、lncRNA-GAS5 的表达高于同时期野生型C57BL/6J小鼠的表达(lncRNA-P21,9w,2.071±0.1717 vs 0.9556±0.07206,P<0.0001,gene/GAPDH)(lncRNA-GAS5,7w,14.08±1.626 vs 5.849±0.2907,P<0.0001,gene/GAPDH)。而 lncRNA-PVT1(7w,3.721±0.2404 vs 5.184±0.7346,P<0.05,gene/GAPDH)、lncRNA-H19(9w,1.71±0.4134 vs 6.235±0.1149,P<0.0001,gene/GAPDH)、lncRNA-MALAT1(9w,1.71±0.4134 vs 6.235±0.1149,P<0.0001,gene/GAPDH)的表达水平低于同时期C57BL/6J小鼠的表达。结论:在日本血吸虫致纤维化疾病中,相比野生型对照小鼠,ICOS-KO小鼠的肝纤维化显著减轻,表明ICOSL/ICOS信号的下调减轻了 HSCs的活化,lncRNA的表达也受到了影响,其中具有抑制纤维化作用的lncRNA-P21、lncRNA-GAS5表达上调,而促纤维化作用的lncRNA-PVT1、lncRNA-H19、lncRNA-MALAT1表达则受到抑制。研究结果提示在日本血吸虫致肝纤维化的病程中,ICOS信号对的lncRNA的表达具有调控作用并可影响肝纤维化的发生、发展。第四部分体外干扰5种lncRNA的表达对HSCs活化的影响目的:观察小鼠肝星状细胞系JS-1转染siRNA对lncRNA介导HSCs活化的影响。方法:肝星状细胞系JS-1传代培养稳定之后,转染siRNA,培养48h后,通过实时荧光定量PCR检测HSCs中α-SAM和I型胶原蛋白的表达。结果:干扰了 lncRNA-P21、lncRNA-GAS5 后可增加 HSCs 中α-SAM 和 I 型胶原蛋白的表达,而干扰lncRNA-PVT1、lncRNA-H19、lncRNA-MALAT1后则可减少HSCs中α-SAM和I型胶原蛋白的表达。结论:实验结果表明,在日本血吸虫感染小鼠致纤维化的疾病中,lncRNA-P21、lncRNA-GAS5 可抑制 HSCs 的活化,而 lncRNA-PVT1、lncRNA-H19、lncRNA-MALAT1则促进了 HSCs的活化。LncRNA有望作为调节HSCs的活化控制肝纤维化的潜在靶点。