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口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染所引起的一种急性、热性、高度接触传染性疫病,主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物。该病传播途径多、传播速度快,曾在世界范围内造成巨大经济损失,被世界动物卫生组织列为法定报告的动物疫病。目前对于该病的防控主要以疫苗免疫预防为主,而且传统灭活疫苗仍占据主导地位。然而,传统疫苗在许多方面仍亟待改进,如存在安全风险、疫苗研发周期较长、免疫反应滞后、免疫保护时间较短等,因此研制新型疫苗对于提高免疫效果和快速有效地防控口蹄疫具有重要意义,而深入研究病毒感染机制和宿主免疫机理将为疫苗研发提供理论基础。研究表明microRNAs(miRNAs)在病毒与宿主细胞相互作用的过程中发挥重要的调节作用,因此,通过操控miRNAs的作用抑制病毒复制是防控病毒病的新型策略。然而,到目前为止,宿主miRNAs在口蹄疫病毒感染过程中的作用及其机理研究很少。基于上述现状,我们以近些年我国境内的流行毒株FMDV/O/BY/2010和其天然宿主细胞系PK-15(猪肾细胞系)为主要研究对象,开展了以下研究工作:1.口蹄疫病毒感染PK-15细胞后宿主miRNAs的差异表达分析。收集口蹄疫病毒感染的PK-15细胞,利用miRNAs芯片技术对细胞中的miRNAs进行了差异表达分析并通过RT-qPCR方法进一步验证,结果表明,口蹄疫病毒感染PK-15细胞后miR-1307的表达受到显著诱导。2.过量表达miR-1307对口蹄疫病毒复制的抑制作用。为了评价miR-1307对口蹄疫病毒的作用,我们将miR-1307用转染模拟物(mimics)和质粒的方法进行过量表达,再用口蹄疫病毒感染后对病毒复制情况进行分析。结果表明miR-1307能够抑制口蹄疫病毒的复制。3.MiR-1307抑制口蹄疫病毒复制的作用机制研究。为了研究miR-1307对口蹄疫病毒自身蛋白表达的影响,我们构建了口蹄疫病毒各个蛋白融合FLAG标签的表达质粒,与miR-1307过量表达质粒共同转染BHK-21细胞,Western blot和RT-qPCR的结果表明过量表达miR-1307可以显著抑制VP1和VP3的表达。双荧光素酶报告载体的构建和检测也得到了相似的结论。这些结果说明miR-1307能够特异性地降低VP1和VP3编码序列的RNA稳定性。我们利用生物信息学软件在VP1和VP3的编码序列中预测了可能性最大的靶位点进行验证,然而这些位点突变后并未显著影响miR-1307对VP1和VP3的调控作用,说明miR-1307的直接靶位点在现有预测范围之外。miR-1307对VP1和VP3的RNA稳定性的调控机制仍需进一步的研究。4.MiR-1307的临床应用前景。MiR-1307在细胞水平对口蹄疫病毒表现出非常明显的抑制效果,因此我们想进一步研究其在实验动物中的作用效果。3日龄乳鼠(Balb/c)颈部皮下注射miR-1307激动剂(agomir)或对照(NC)后攻毒,结果表明注射miR-1307激动剂能够显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应,说明其有被用于口蹄疫防控的潜能。综上所述,本研究成功鉴定到1个猪源miRNA miR-1307,该miRNA的表达受到口蹄疫病毒感染的显著诱导。我们的研究表明miR-1307能够特异性地降低口蹄疫病毒基因组VP1和VP3编码序列的RNA稳定性而抑制口蹄疫病毒的复制。而且,注射miR-1307激动剂能够显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应,说明其有临床应用前景。