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半夏泻心汤方出自《伤寒杂病论》,具有寒热平调、消痞散结、辛开苦降、补泻同施、化痰行瘀功效。前期研究表明半夏泻心汤具有抑制体外胰岛β细胞凋亡、促进胰岛素分泌的作用,但具体机制有待进一步探索。本实验结合体内体外实验,进一步证实半夏泻心汤对胰岛细胞的保护作用,并探索其作用机制。目的:通过体内实验(糖尿病(Diabetes mellitus,DM)小鼠)与体外实验(MIN6细胞)相结合,观察半夏泻心汤(Banxia Xiexin Decoction,BX)对高脂饲料联合链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的DM小鼠胰岛细胞以及过氧叔丁醇(t-butylhydroperoxide,TBHP)诱导的MIN6细胞损伤的保护作用。探讨半夏泻心汤对DM小鼠胰岛细胞以及MIN6胰岛细胞的保护作用机制。方法:1.动物实验:8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分为6组。高脂饲料饲喂8周后腹腔注射STZ 55mg/kg,持续注射3天进行造模。实验共分为6组:正常组(Con)、模型组(Mod)、二甲双胍组(MET)、半夏泻心汤低剂量组(BXL)、半夏泻心汤中剂量组(BXM)、半夏泻心汤高剂量组(BXH)。连续灌胃7周,每2周监测体重,于给药第0周、3周、7周测量小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)。7 周后取血,检测糖化血红蛋白(Hemoglobin A1C,HbA1c)、空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)及血脂四项(TC、TG、HDL-C、LDL-C),并取胰腺置于-80℃保存备用。各组小鼠干预7周末测定FBG后,予2g/kg葡萄糖溶液灌胃,分别于糖负荷后30min、60min、120min测定血糖值,根据各时间点血糖值绘制口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)曲线,并计算血糖曲线下面积(Area under the curve,AUC)。进行胰腺HE染色,原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)检测胰岛细胞凋亡率、试剂盒检测胰腺组织匀浆MDA、SOD的含量,Western blot法检测PI3K/AKT/FOXO1信号通路及相关蛋白的表达。2.细胞实验:取对数生长期MIN6细胞,0.25%胰酶消化后加入高糖DMEM培养液,PBS吹打并制成单细胞悬液并接种于96孔板,每孔加入100μL单细胞悬液后置于培养箱中培养。待细胞贴壁后,加入不同浓度的半夏泻心汤(0.1、0.5、1、1.5、2.5、5、10mg/ml)孵育12h后进行MTT实验,酶标仪检测OD值,并计算细胞活力以确定半夏泻心汤的浓度范围。细胞贴壁生长后加入半夏泻心汤(0.25、0.5、1mg/ml)预处理细胞12h,药物孵育结束后加入100μM的TBHP孵育2h。TBHP处理结束后弃去孔内液体进行MTT实验,用酶标仪检测OD值,以筛选半夏泻心汤的最终孵育浓度。实验分为以下5组:对照组(Con,DMEM高糖培养液)、模型组(Mod,DMEM高糖培养液+TBHP)、半夏泻心汤组(BX,DMEM高糖培养液+TBHP+0.5mg/ml的半夏泻心汤)、半夏泻心汤+抑制剂组(BX+LY,DMEM 高糖培养液+TBHP+0.5mg/ml 的半夏泻心汤+LY294002(100μM))、抑制剂组(LY,DMEM 高糖培养液+TBHP+LY294002(100μM))。Hoechst 33342法与TUNEL法检测半夏泻心汤对TBHP诱导的细胞凋亡的影响。并进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(GSIS实验),采用ELISA法分别检测胰岛素水平。DCFH-DA探针检测细胞内ROS含量,试剂盒检测细胞内MDA、SOD、GSH-Px含量。Western blot法检测PI3K/AKT/FOXO1信号通路及相关蛋白的表达。结果:1.动物实验:(1)半夏泻心汤对各组小鼠体重的影响:小鼠自造模成功始,模型组小鼠体重低于其他各组。对照组小鼠体重逐渐增加。至第7周灌胃结束后,对照组小鼠体重明显大于模型组(P<0.05)和各药物干预组(P>0.05);模型组小鼠与各药物干预组小鼠之间体重无统计学差异(P>0.05)。(2)半夏泻心汤对各组小鼠糖脂代谢的影响:造模成功后,模型组、二甲双胍组、半夏泻心汤组血糖水平均显著高于对照组(P<0.05)。灌胃第3周及第7周后,模型组血糖显著高于对照组血糖(P<0.05);与模型组相比,二甲双胍组、半夏泻心汤组血糖水平显著低于模型组(P<0.05)。与对照组相比,模型组小鼠糖化血红蛋白含量、TC、TG、LDL含量均显著增加(P<0.05),HDL含量显著下降(P<0.05);与模型组相比,二甲双胍组、半夏泻心汤组糖化血红蛋白含量、TC、TG含量均有明显下降(P<0.05),HDL含量显著增加(P<0.05)。(4)半夏泻心汤对各组小鼠胰岛素分泌及HOMA-β指数的影响:与对照组相比,模型组小鼠空腹胰岛素水平及HOMA-β指数显著下降(P<0.05);与模型组相比,二甲双胍组、半夏泻心汤组空腹胰岛素水平及HOMA-β指数均有明显提高。(5)半夏泻心汤对各组小鼠葡萄糖耐量及AUCOGTT的影响:与对照组相比,模型组小鼠在灌胃葡萄糖前后各时间点血糖水平均显著升高(P<0.05)。OGTT Omin时,与模型组相比,二甲双狐组、半夏泻心汤组小鼠血糖水平均有显著下降(P<0.05)。OGTT 30min时,各组小鼠血糖水平均显著升高。OGTT 60min时,与模型组相比,二甲双胍组、半夏泻心汤组小鼠血糖水平开始显著下降(P<0.05)。OGTT 120min时,与模型组相比,二甲双胍组、半夏泻心汤组小鼠血糖水平均有显著下降(P<0.05)。与对照组相比,模型组小鼠AUCOGTT显著增加(P<0.05);与模型组相比,二甲双胍组、半夏泻心汤组小鼠AUCOGTT均有显著下降(P<0.05)。(6)半夏泻心汤对各组小鼠胰腺形态的影响(HE染色法):正常小鼠胰腺组织的胰岛为圆形或椭圆形的细胞团,胞团大小不一,结构完整、规则、边缘清晰,散布于胰腺腺泡之间,细胞团数量较多,胰岛内β细胞丰富、大小均匀、饱满充盈、排列紧密;而模型组小鼠胰岛细胞团数量减少,胰岛面积萎缩、形态各异不规整、胰岛边缘不清、结构紊乱,胰岛内β细胞肿胀、变形,细胞质染色变浅或呈空泡化现象,核固缩或核缺失现象明显,且部分胰腺外分泌腺腺泡深入胰岛内部;与模型组小鼠相比,各药物干预组小鼠胰岛及胰岛内细胞数目增加,形态结构有所改善。(7)半夏泻心汤对各组小鼠胰岛B细胞凋亡的影响:与对照组相比,模型组小鼠细胞凋亡率显著增加(P<0.05);与模型组相比,二甲双胍组、半夏泻心汤组细胞凋亡率均有明显下降(P<0.05)。(8)半夏泻心汤对各组小鼠氧化应激指标的影响:与对照组相比,模型组小鼠MDA含量显著增加(P<0.05),SOD含量显著降低(P<0.05);与模型组相比,二甲双胍组、半夏泻心汤组MDA含量明显下降(P<0.05);SOD含量明显提高(P<0.05)。(9)半夏泻心汤对各组小鼠PI3K/AKT/FOXO1信号通路及相关蛋白表达的影响:与对照组相比,模型组 p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1、Pdx-1/β-actin、MafA/β-actin 比值均明显下降(P<0.05);Caspase-3/β-actin、Bax/β-actin、P27/β-actin比值均明显增加(P<0.05)。与模型组相比,二甲双胍组、半夏泻心汤剂量组 p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1、Pdx-1/β-actin、MafA/β-actin 比值均显著提高(P<0.05);Caspase-3/β-actin、Bax/β-actin、P27/β-actin 比值显著下降(P<0.05)。2.细胞实验:(1)半夏泻心汤对MIN6细胞毒性的影响:当半夏泻心汤浓度≥2.5 mg/ml时,MIN6细胞活力显著下降。因此,后续实验选择0.25、0.5、1.0 mg/ml 3个浓度进行。(2)半夏泻心汤对TBHP诱导的MIN6细胞增殖抑制的影响:与对照组相比,模型组细胞活力显著下降(P<0.05)。与模型组相比BX0.5剂量组和BX1.0剂量组细胞活力显著增加(P<0.05),BX0.5剂量组和BX1.0剂量组间无显著差异(P>0.05),但BX0.5剂量组细胞活力略高,故最终选择半夏泻心汤0.5 mg/ml剂量组为半夏泻心汤药物干预组。(3)半夏泻心汤对TBHP诱导的MIN6细胞凋亡的影响:Hoechst 33342染色显示对照组细胞完整,其细胞核均匀染色。在TBHP刺激后,细胞不规则地固缩并聚集,显示出致密的浓染,细胞核分裂成碎片。与模型组相比,半夏泻心汤组核固缩、致密浓染和细胞碎片减少,细胞形态有所改善。与对照组相比,模型组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。与模型组相比,半夏泻心汤预处理12h可显著降低细胞凋亡率(P<0.05)。(4)半夏泻心汤对葡萄糖刺激的胰岛素的分泌的影响:模型组MIN6细胞的功能受损,与2.8mM模型组相比,16.7mM模型组的葡萄糖刺激的胰岛素分泌未见明显增加(P>0.05)。而半夏泻心汤预处理12h后16.7mM半夏泻心汤组的葡萄糖刺激的胰岛素分泌明显增加,改善了胰岛细胞的功能(P<0.05)。(5)半夏泻心汤对各组细胞氧化应激指标的影响:与对照组相比,模型组细胞内ROS及MDA含量显著增加(P<0.05);SOD及GSH-Px含量显著降低(P<0.05)。与模型组相比半夏泻心汤组细胞内ROS及MDA含量显著减少(P<0.05);SOD 及 GSH-Px 含量显著增加(P<0.05)。(6)半夏泻心汤对PI3K/AKT/FOXO1信号通路及相关蛋白表达的影响:与对照组相比,模型组p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1、Pdx-1/β-actin 比值均明显下降(P<0.05);Caspase-3/β-actin、Bax/β-actin、P27/β-actin 比值均明显增加(P<0.05)。与模型组相比半夏泻心汤组p-AKT/AKT、p-FOXO1/FOXO1、Pdx-1/β-actin 比值显著提高(P<0.05);Caspase-3/β-actin、Bax/β-actin、P27/β-actin 比值显著下降(P<0.05)。而加入PI3K抑制剂后半夏泻心汤提高p-AKT/AKT 比值表达的作用被抵消。结论:1.半夏泻心汤具有显著改善DM小鼠糖脂代谢、胰岛功能、胰腺组织结构损害的作用,可明显抑制胰岛β细胞凋亡、促进胰岛素分泌。2.半夏泻心汤具有抑制MIN6细胞凋亡、促进胰岛素分泌、保护MIN6细胞的作用。3.半夏泻心汤对DM小鼠胰岛细胞和MIN6细胞的保护作用可能是通过抑制氧化应激、增强机体抗氧化能力;激活PI3K/AKT/FOXO1信号通路,并产生级联反应,影响下游Caspase-3、Bax、P27、MafA和Pdx-1蛋白的表达有关。创新点:1.本研究证明半夏泻心汤可改善DM小鼠和MIN6胰岛β细胞凋亡、促进胰岛素分泌,保护胰岛细胞,为半夏泻心汤的临床应用提供了实验依据。2.通过体内与体外实验相结合,证实半夏泻心汤是通过减轻氧化应激损伤、增强机体抗氧化能力;激活PI3K/AKT/FOXO1信号通路,并产生级联反应,影响下游Caspase-3、Bax、P27、MafA和Pdx-1蛋白的表达发挥保护胰岛细胞的作用。