论文部分内容阅读
目的：构建小鼠B7-H4靶向shRNA稳定转染的鼠间充质干细胞株C3H10T1/2(以下简称C3H10)，通过体内外实验探讨B7-H4分子在C3H10细胞移植治疗EAE中的免疫抑制作用。方法：应用流式细胞仪、Western blot等方法检测C3H10细胞中B7-H4分子的表达情况；将装载有小鼠B7-H4分子小片段shRNA的慢病毒颗粒转染C3-H10细胞系(C3H10-shRNA-B7-H4)；利用载体的嘌呤霉素抗性筛选转染的C3-H10细胞，通过荧光显微镜及流式细胞仪（FCM）检测shRNA的转染效率。通过流式细胞仪、RT-PCR及Western blot等方法检测不同序列的特异性shRNA干扰C3-H10细胞后B7-H4分子的mRNA及蛋白表达水平，得到干扰效率较好的一株C3-H10-shRNA-B7-H4细胞，将其与小鼠脾脏淋巴细胞共同培养，用FCM检测其对淋巴细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的作用。建立EAE小鼠模型，分假手术组、造模组、C3H10细胞移植组、C3H10-shRNA-NC细胞移植组、C3H10-shRNA-B7-H4细胞移植组，其中C3H10细胞移植组、C3H10-shRNA-NC细胞（转染了未含靶向分子的对照shRNA的C3H10)移植组、C3H10-shRNA-B7-H4细胞（转染了含靶向分子B7H4shRNA的C3H10)移植组在免疫后第8天分别将C3H10细胞、C3H10-shRNA-NC细胞、C3H10-shRNA-B7-H4细胞注入建立的EAE模型小鼠体内，观察各组小鼠的发病神经功能评分及体重变化情况，与对照组相比较。结果：FCM及Western blot检测显示C3-H10细胞高表达B7-H4分子；荧光显微镜及FCM检测显示shRNA转染C3-H10细胞的效率高达80%以上；通过嘌呤霉素筛选后得到的C3-H10细胞转染效率在95%以上，且能稳定传代；有4对特异性shRNA对B7-H4mRNA及蛋白均有不同程度的下调，其中以shRNA-1对B7-H4的下调作用最强，作为最佳特异性shRNA；C3-H10能明显抑制经PHA激发的小鼠脾脏细胞的活化和增殖，使细胞周期阻滞于G0/G1期，该免疫抑制效应在PHA激发的脾细胞与C3-H10-shRNA-B7-H4细胞共培养组被部分逆转；C3-H10细胞可保护与其共培养的PHA激发的小鼠脾脏淋巴细胞免受AICD，此效应在其与C3-H10-shRNA-B7-H4细胞共培养组被部分逆转。体内实验显示假手术组无发病，C3H10细胞植入组及C3H10-shRNA-NC细胞植入组较造模组发病时间延迟且发病症状较轻，神经功能评分维持在较低水平，体重呈持续增长趋势；而C3H10-shRNA-B7-H4植入组发病时间介于C3H10细胞移植组及造模组之间，发病高峰与造模组同时期，神经功能缺损评分介于C3H10细胞移植组及造模组之间，但发病小鼠转归较造模组好。结论：1、成功构建了小鼠B7-H4靶向shRNA稳定转染的小鼠间充质干细胞株C3H10T1/2，B7-H4分子表达明显下调。2、体外实验显示B7-H4分子参与了C3H10细胞对小鼠脾脏细胞活化、增殖的免疫抑制作用，使多数细胞细胞周期阻滞于G0/G1期，表达B7-H4的C3H10细胞能够保护经PHA刺激的小鼠淋巴细胞免受AICD。3、体内实验显示B7-H4分子在C3H10细胞移植治疗小鼠EAE模型的病理过程中发挥了一定作用。