目的:艾滋病是由人类免疫缺陷病毒I型（human immunodeficiency virus-I,HIV-I）引起的严重危害人类健康的传染性疾病,尽管高效抗反转录病毒治疗可显著降低HIV感染者的发病率和病死率,但由于病毒储存库的存在,使艾滋病至今仍无可行的根治方法,且无有效的疫苗。HIV自然感染过程中,人类白细胞抗原I（human leukocyte antigen,HLA-I）限制性T细胞应答在控制病毒复制中起重要作用。目前,许多预防性及治疗性疫苗的设计策略均旨在诱导出能够识别并杀伤HIV-1的病毒特异性T细胞应答。然而,由于不同人群HIV流行毒株的多态性及宿主遗传背景的差异,其疫苗研发比其他病原体疫苗更为艰难。因此探索不同亚型HIV感染者HLA限制性T细胞表位差异,明确保护性T细胞应答特征,对于开发基于T细胞免疫应答疫苗及免疫疗法具有重要的意义。在HIV感染者体内,HLA限制性T细胞应答对病毒的控制是一个动态变化的过程。一方面,HLA限制性T细胞应答能够抑制HIV-1病毒复制,急性期T细胞应答的出现伴随着病毒载量的明显下降,并在很大程度上决定着病毒调定点水平的高低,进而与不同的疾病进展有关。在慢性感染期,T细胞应答在一定程度上决定着无症状生存期的长短,疾病进展加快常伴随着病毒逃逸突变的出现。此外,在HIV感染者体内不同表位特异性T细胞应答的出现具有一定的等级顺序,部分病毒特异性T细胞应答在感染急性期即可检测到,部分T细胞应答在感染后期才逐渐形成,因此动态分析HIV感染者T细胞应答的特征,对于明确感染不同时期可能存在的保护性免疫应答是十分必要的。另一方面,HIV病毒存在高度变异性,且病毒在感染者体内免疫选择压力下不断变异以逃逸宿主免疫应答,部分变异能够降低病毒复制适应性,而病毒又能够通过一些补偿变异部分恢复病毒复制适应性,最终使变异在人群传播过程中固定下来,逐渐带上宿主选择的印迹。病毒的适应性进化使宿主的保护性T细胞应答反应逐渐失效,可能与较快疾病进展有关。因此,在进行疫苗或免疫治疗设计前需充分了解目标人群流行毒株表位变异特征。探索特定遗传背景下HIV感染者保护性T细胞应答的动态变化规律,将有助于提高疫苗或免疫治疗的有效性。近年来,CRF01_AE已成为我国主要流行HIV-1亚型,尤其是在我国当前疫情最为严重的男男同性恋者（men who have sex with men,MSM）中,CRF01_AE毒株在大多数地区占比最高,其次是CRF07_BC和B亚型以及其他重组亚型。迄今多项研究发现我国MSM人群HIV感染者疾病进展较快,是否与病毒的T细胞应答表位已经普遍发生适应性进化有关仍不明确,是否存在特定遗传背景下的保护性免疫应答也不清楚。因此本研究将以我国MSM人群为研究对象,分析不同亚型毒株在国际报道的保护性HLA,包括HLA-B^*27、B^*57、B^*5801、B^*13及B^*51限制性T细胞应答表位的变异情况,探索其与感染者疾病进展的关系,并进一步将研究对象锁定到MSM人群HLA-B^*13阳性的CRF01_AE亚型HIV-1感染者,个体化追踪研究感染一年内的B^*13限制性T细胞应答的发生及演变,应用下一代测序技术（Next generation sequencing,NGS）揭示逃逸突变的发生及累积变化规律,明确可能存在的保护性免疫应答,为疫苗免疫原的选择提供科学依据。研究方法:一研究对象:论文一:本团队从2008年开始对辽宁大规模MSM高危人群队列进行定期随访并进行HIV感染筛查试验、Western Blot确认试验,对血清学筛查试验阴性者进行集合核酸检测,HIV核酸检测阳性后再次招募患者进行筛查和确认试验。HIV-1患者估计感染时间的判定方法为:初筛和确认试验阳性患者以此次阳性与末次随访检测阴性的中间时间作为HIV感染时间;对于初筛阳性,Western Blot确认试验结果为不确定,高危行为不确定时则以检测时间前30天作为估计感染时间;对于初筛阴性但核酸检测阳性患者,则以核酸阳性时间点前14天作为HIV感染时间,有可靠高危性行为史的患者则结合高危行为史进行判定。根据患者HIV-1核酸检测结果及血浆中的抗原和抗体测试进行fiebig分期。截止到2012年共招募到54例HIV早期感染者,纳入标准为1)年龄在18-65岁;2)HIV估计感染时间在6个月以内;3)HIV-1阳转后第一时间点CD4⁺T细胞计数>350 cells/μl,未经抗病毒治疗。论文二:在论文一基础上继续对高危人群队列进行定期随访,截止2014年共纳入12例HLA-B^*13型的CRF01_AE毒株感染者。纳入标准:1)年龄在18-65岁;2)HLA分型为HLA-B^*13阳性;3)HIV-1亚型分型结果为CRF01_AE;4)HIV估计感染时间在3个月以内;5)招募初始至1年内未经抗病毒治疗。排除标准:1)入组前60天内接受其他药物试验;2)发生合并感染。获得上述患者感染基线点、3个月点及1年点的全血样本,分离血浆,进行病毒序列分析,应用密度梯度离心分离外周血单个核细胞进行T细胞应答纵向研究。论文三:研究对象同论文二纳入本课题研究的所有患者均签署了知情同意书,并通过了中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准。二.实验方法1、CD4⁺T细胞计数:将20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入CD4绝对计数管中,加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素450μl,室温避光15min,FACSMULTISET软件检测并进行自动分析,计算CD4⁺T、CD8⁺T、CD3⁺T淋巴细胞绝对值及相应比值等。2、病毒载量检测:应用Roche公司的COMBAS AmpliPrep/COMBAS Taqman仪器进行HIV病毒载量（Viral load,VL）的检测,检测范围为25-10⁶ copies/ml。3、DNA提取:外周血白细胞DNA的提取,使用1ml EDTA抗凝外周静脉血,采用QIAamp DNAMini试剂盒,按照试剂盒说明书标准方法快速提取全基因组DNA200μl。将纯化后的DNA置.20℃保存备用。4、HLA等位基因分型检测:应用One Lambda公司的Micro SSP型试剂盒进行HLA分型（PCR-SSP方法）。根据产物有无及片段的大小,对照Micro SSP^TMHLA-I类基因DNA分型判读卡确定基因型。5、血浆标本HIV RNA提取:收集HIV感染者全血并分离血浆,采用QIAamp RNA Mini Kit试剂盒,按照说明书标准protocol从140μl感染者血浆中快速提取出60μl HIV病毒RNA,采用SuperScript ^III将病毒RNA逆转录为cDNA后,利用巢式PCR方法对目的片段进行扩增。6、近全长HIV-1基因组测序和感染者病毒序列亚型鉴定:通过巢式PCR（nested-PCR）方法进行单基因组扩增（SGA）,获得近全长的基因组片段。从Los Alamos HIV序列数据库下载HIV-1参考序列,使用Align对HIV-1基因序列和参考序列进行比对。应用Mega软件构建基于pol序列的系统进化树,判定感染的HIV病毒亚型。7、肽段合成:根据前期获得的50余条辽宁新发CRF01_AE-lineage-2的全长序列,利用BioEdit软件合成共享氨基酸序列,根据论文一筛选出的6个HLA-B^*13限制的表位针对CRF01_AE亚型的共享序列合成相应肽段（Sigma-Aldrich,美国）。纯度>80%,包括:Gag-HQSLSPRTL（HL9）,Gag-VQNAQGQMV（w9）,Gag-GQMREPRGSDI（GI11）,Gag-RQANFLGRL（RL9）Pol-GQDQWTYQI（GI9）,Pol-RQYDQILIEI（RI9）（Sigma-Aldrich,US）。同时针对论文第三部分患者自体病毒序列及进化过程中出现的变异情况合成纯度>95%的逃逸突变肽（GL Biochem,中国）。8、ELISPOT法测T细胞应答检测采用美国BD公司ELISPOT试剂盒测定。用相应的抗体包被PVDF膜96孔板,每孔加入100μl浓度为1×10⁶/ml的患者PBMC,同时加入多肽,反应终浓度为5μg/ml;阳性对照孔加入4μl PHA,终浓度为10μg/ml,阴性对照孔加入完全培养基,每孔反应总体积为200μl每份样本做两个阳性对照和两个阴性对照,37℃、5%CO₂孵育20-24小时。加入生物素标记的检测抗体,室温孵育2小时后加入辣根过氧化酶标记的链菌亲和素,1小时后加入显色剂,30min-45min后终止反应。用美国C.T.L公司的Immunespot分析仪读取孔中斑点个数。反应结果为反应孔阳性反应点数减去阴性对照孔的数值后,结果根据孔中细胞浓度换算成每10⁶个PBMC中点形成细胞个数,即点形成单位（spot forming unit,SFU）。9、含有免疫显性表位基因片段的扩增将逆转录为cDNA后的RNA样本,利用巢式PCR方法对目的片段进行扩增。第一轮gag扩增引物为5’-ATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3’和5’-TAATGCTTYTATTTTYTCTTYTGTYAATGGC-3’,pol扩增引物为5’-TGGAAATGTGGRAARGARGGAC-3’和5’-CCTGTHTGCAGHCCCCAATATGTT-3’;第二轮Pol-GI9扩增引物为5’-AGCTGGACTGTCAATGATATAC-3’和5’-TTTCCCCATATTACTATGCT-3’,Gag-GI11扩增引物为5’-GGAGCCACCCCACAAGATTTAAA-3’和5’-CAAGGTTTCWGTCATCCARTTTTT-3’,Gag-VV9扩增引物为5’-GAYACCAARGAAGCYTTAGA-3’和5’-GTTCCTGCTATRTCACTWCCCCTYGGTTC-3’10、PCR扩增产物的鉴定:配置1%的琼脂糖凝胶,完全冷却前加入TB显色剂。以DL2000 DNA Maker为片段大小判断标准,100V直流电压下运行30min。之后将琼脂糖凝胶置于成像仪上,观察所获得的PCR产物片段大小是否符合预期。11、PCR产物的纯化及定量:按照Beckman Coulter公司开发的Beckman磁珠纯化试剂盒说明书操作步骤,对PCR产物进行纯化。应用QUBIT荧光定量分析仪对PCR产物进行准确定量,为下一步构建文库做准备。应用KAPA qPCR试剂盒定量方法对制备好的文库进行定量。12、深度测序:基于PCR产物QUBIT定量结果,以130-150ng质量输入量为标准进行文库构建。严格参照Truseq Nano DNA HT Library Prep protocol中叙述的操作流程,其主要步骤为,末端修饰及片段化→3’端“A”尾修饰→连接Adapter→文库扩增→文库定量→文库标准化→Miseq上机。13、生物信息学处理:首先下载Virtual Box构建分析软件QIIME2的工作环境,在QIIME2中导入已拆分好的待分析样本。进入DADA2选项选择Denoise and dereplicate paired-end sequence,获得每例样本各种序列组成的代表性序列及比例。14、统计分析:用Mann-Whitney U检验比较保护性HLA组和非保护性HLA组的年龄、CD4 T细胞计数和VL。以CD4⁺T细胞计数<350 cells/μl或VL>10⁵ copies/ml为事件终点,运用Kaplan-Meier曲线和对数秩（Mantel-Cox）进行生存分析。使用Fisher精确检验分析不同组间逃逸突变的比例。利用聚类3.0软件中对每名受试者表位突变特征与HIV亚型之间的相关性进行聚类分析。用Mann-Whitney U检验比较不同亚型的突变率。运用配对T检验方法检测不同时间点总体或单个表位应答强度及频率的变化。应用Sperman秩相关检验对总体应答强度、不同时间点单个表位应答强度或相对应答强度与CD4⁺T细胞计数、VL、病毒调定点（Setpoint）VL的相关性。用Mann-Whitney U检验比较不同时间点每个表位应答组与非应答组CD4⁺T细胞计数、VL、setpoint VL的差异。应用SPSS 18.0软件进行统计学分析,应用Graphpad Prism5.0作图,P<0.05认为有统计学意义。结果:一、我国MSM人群HIV-1感染者保护性HLA限制性T细胞表位变异与疾病进展关系的研究1、本研究分析了54例MSM人群HIV-1早期感染者,其中CRF01_AE、CRF07_BC及B亚型感染者分别为占88.89%、5.56%及5.56%。根据是否存在保护性HLA型（B^*13、B^*51、B^*27、B^*57和B^*5801）分为两组,结果发现两组人群的中位年龄、Fiebig分期、VL、CD4⁺T细胞计数、基线CD4⁺T细胞百分比和CD4/CD8比值以及HIV亚型均具有可比性（P>0.05）。Kaplan-Meier生存分析发现两组人群CD4⁺T细胞计数下降到350 cells/μl以下和VL增加到大于10⁵ copies/ml的时间无显著差异（P=0.971和P=0.081）,表明已报道的保护性HLA型在我国MSM人群HIV-1早期感染者中已经失去保护作用。2、本研究进一步分析了上述保护性HLA型限制的32个表位的变异,结果发现96.88%（31/32）的表位具有多态性,平均变异率为70.02%,且发现在96.88%（31/32）的表位中,HLA匹配组和HLA不匹配组的变异率无显著性差异（P>0.05）,表明上述表位在的变异在人群中普遍存在。3、为了进一步探讨不同亚型32个表位的变异的特征,我们根据每个受试者32个表位的是否发生变异进行了分层聚类分析,在确定的4个亚簇中,96.30%（52/54）分簇的分类与感染者的HIV-1亚型一致,且不同亚型表位的保守程度及变异的氨基酸频率和种类存在差异,表明这些保护性HLA限制性表位的变异特征具有亚型特异性。4、最后,本研究发现CRF01_AE两个进化簇lineage-1和lineage-2,即CRF01_AE-1和CRF01_AE-2表位变异率均显著高于非CRF01_AE组（76.82%vs48.96%,P=0.004;71.27%vs 48.96%,P=0.010）,且通过Kaplan-Meier生存分析发现,CRF01_AE-1和CRF01_AE-2的感染者比非CRF01_AE亚型感染者疾病进展更快（P=0.035）。提示CRF01_AE感染的患者保护性HLA限制性T细胞表位变异可能与快速疾病进展有关。二、我国MSM人群HLA-B^*13阳性CRF01_AE亚型HIV-1感染者T细胞应答特征研究1、通过分析6例B^*13阳性CRF01_AE亚型HIV早期感染者3个月点T细胞应答时发现,针对Pol-GI9、Gag-GI11及Gag-VV9表位应答的频率较高,分别为50.00%、50.00%和33.33%,平均应答强度分别为583.33±792.43、425.00±727.92和±958.95（SFU/10⁶ PBMC）;分析12例B^*13阳性CRF01_AE亚型HIV感染者1年点时T细胞应答发现,针对Pol-GI9、Gag-GI11及Gag-VV9表位特异性T应答的频率为75.00%、58.33%及50.00%,应答强度分别为526.67±759.36、390.83±666.28和610.00±908.91（SFU/10⁶ PBMC）。因此,Pol-GI9、Gag-GI11及Gag-VV9表位为该人群免疫显性表位。2、本研究纵向比较了6例B^*13阳性CRF01_AE亚型HIV早期感染者3个月点和1年点针对免疫显性表位的应答,结果显示总应答强度及应答频率无显著性差异（1423.33±1378.31 vs 1916.67±878.97 SFU/10⁶ PBMC,P=0.397;44.44%vs72.22%,P=0.093）;单个表位Pol-GI9、Gag-GI11及Gag-VV9特异性T细胞应答强度在3个月及1年点无显著性变化（P>0.05）。结果提示,B^*13限制的免疫显性表位特异性T细胞应答在感染3个月即可检测到,到1年点时应答强度未显著性增加。3、B^*13阳性CRF01_AE亚型HIV早期感染者3个月点时Pol-GI9表位特异性T细胞应答强度与VL呈正相关趋势（r=0.786,P=0.064）,在3个月点时Gag-VV9表位有应答组CD4⁺T细胞计数显著低于无应答组（246.50±83.5 vs.555.75±48.54,P=0.026）,可能与较快疾病进展有关;1年点时Gag-GI11表位的相对应答强度与CD4⁺T细胞计数有正相关趋势（r=0.537,P=0.072）,可能与较慢疾病进展相关,仍具有一定的保护作用。三、我国MSM人群CRF01_AE亚型HIV-1感染者B^*13限制性T细胞应答驱动的病毒变异研究1、Pol-GI9表位在人群中变异率低,仅1例患者（321145）在感染38天检测到D490G（61.85%）和G488E变异（38.15%）,在纵向随访过程中,G488E变异株逐渐消失。在320019和325029患者中进行了D490G逃逸突变的验证,发现Pol-GI9表位特异性T细胞应答对D490G变异无交叉反应活性,表明D490G变异可能为完全逃逸突变。2、发生在Gag-GI11表位内的氨基酸变异率较低,仅3例患者出现了M228I变异,占该时间点序列的75.68%、29.71%和3.10%。我们在320019及325020患者中进行了M228I相关逃逸突变的验证,结果显示,野生型及M228I变异肽具有良好的交叉反应活性。3、发生在Gag-VV9表位内的氨基酸变异率较高（58.33%）,且出现多种氨基酸变异,包括（M142W/V143T同时变异）、V143T、A139T和V143A。我们在320088、325029及320019患者中进行了逃逸突变验证,结果发现（M142W/V143T同时变异）、V143T、A139T和V143A等变异均能在一定程度上部分逃逸T细胞应答,考虑到Gag-VV9表位特异性T细胞应答与加快疾病进展相关,且易出现变异,此表位可能不适合用于T细胞疫苗靶点。结论:1、我国MSM人群流行的HIV病毒在常见保护性HLA型（包括HLA-B^*13、B^*51、B^*27、B^*57和B^*5801）限制性最佳表位内存在较高的变异率,其变异的特征具有亚型特异性,该人群进展快可能与保护性HLA限制性T细胞表位内高变异率有关2、我国MSM人群B^*13阳性CRF01_AE亚型感染者免疫显性应答表位为Pol-GI9、Gag-GI11及Gag-VV9表位。Pol-GI9及Gag-VV9表位特异性T细胞应答可能与较快疾病进展有关;Gag-GI11表位特异性T细胞应答可能与较慢疾病进展相关,仍具有一定的保护作用。3、Gag-GI11表位内的氨基酸变异率较低,针对该表位的T细胞应答对于表位内的M228I变异具有较好的交叉反应活性,且与缓慢疾病进展有关,可优先考虑作为T细胞疫苗或免疫治疗靶点;Pol-GI9表位及Gag-VV9表位可能不适合T细胞疫苗或免疫治疗靶点。