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背景和目的甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)约占甲状腺癌的85%,可发生于任何年龄段,是一种较常见的、恶性度较低的甲状腺癌。近年来,受环境、遗传、激素等的影响,甲状腺乳头状癌的发病率呈逐年上涨趋势。MiRNA是一类广泛存在于动植物体内的非编码RNA,主要参与基因转录后水平的调控,通过与其目标mRNA的3’UTR互补匹配降解靶mRNA或抑制其翻译,广泛地参与多种机体生理过程,包括细胞的生长、发育、增殖、分化和凋亡等生命活动。在甲状腺癌相关研究中,大量miRNA己被挖掘,同时有研究表明,miR-146b、miR-221、miR-222、miR-135b等都在甲状腺乳头状癌中特异表达。研究证实,miRNA-637在急性脑缺血过程中表达,同时具有抑制胶质瘤细胞生长、迁移和侵袭的作用。但是miRNA-637与甲状腺乳头状癌的侵袭转移是否有关系,它通过什么机制来促进甲状腺乳头状癌的发展均尚不清楚。本研究通过应用miRNA靶基因预测软件Target Scan、miRanda和miRWalk分析miR-637的潜在靶基因,发现miR-637能够靶向结合AKT3 3’ UTR的CCCCCAG序列,并通过双荧光素酶报告基因分析系统验证miR-637与之特异结合,从而调控PI3K-AKT3-mTOR信号通路并影响着甲状腺乳头状癌细胞的侵袭转移。因此,我们运用RT-PCR检测miRNA-637在甲状腺乳头状癌中的表达情况,Western blot检测AKT3蛋白在PTC中的表达情况,并分析其与临床病理的相关性。接着采用慢病毒介导稳定转染甲状腺乳头状癌细胞,使miRNA-637在细胞中过表达,分析转染前后甲状腺乳头状癌细胞的生物学行为,应用分子生物学技术验证miRNA-637与AKT3之间的靶向调控关系,通过应用RNA干扰技术敲除AKT3基因,观察其对TPC-1细胞侵袭迁移能力的影响。本研究将阐明miR-637调控甲状腺癌细胞侵袭转移的机制,获得调节甲状腺癌细胞侵袭转移的重要microRNA,为甲状腺癌的靶向性治疗提供实验依据。材料与方法1、随机数字法选取56例PTC肿瘤组织及其与癌灶相隔2cm以上的非癌上皮(non-carcerous epithelium,NCE)组织,运用 RT-PCR 检测 miRNA-637 在 PTC肿瘤组织及癌旁组织中的表达情况,Western blot检测AKT3蛋白在PTC肿瘤组织及癌旁组织中的表达情况,分析miRNA-637与AKT3在PTC肿瘤组织与癌旁组织中的表达差异,miRNA-637与AKT3表达水平与临床病理特征之间的关系,分析miRNA-637表达与AKT3表达之间的关系;2、构建人miR-637慢病毒过表达载体,建立稳定过表达miR-637的甲状腺乳头癌细胞株TPC-1细胞株。3、通过CCK-8检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞周期及凋亡、划痕实验、侵袭迁移实验、平板克隆等实验检测转染前后TPC-1细胞生物学行为。4、应用Western blot和PCR技术分别检测转染过表达miR-637的转染组、空载体组和对照组细胞中PI3K-AKT3-mTOR信号通路的关键蛋白AKT3表达情况;通过应用RNA干扰技术敲除AKT3基因,采用划痕实验和tr6nswell小室侵袭实验观察沉默AKT3前后对TPC-1细胞的迁移和侵袭能力的影响。5、采用SPSS17.0统计软件进行数据分析,两样本率的比较用四格表资料的卡方检验,多样本均数的比较采用单因素方差分析,两样本定量资料采用t检验,以P<0.05为差异具有显著统计学意义。结果1、MiR-637在甲状腺乳头状癌组织中低表达,其表达量与在肿瘤组织的TNM分期、病理分级以及局部淋巴结转移情况等密切相关,甲状腺乳头状癌组织中miR-637的表达与AKT3的表达呈负相关。2、经限制性内切酶鉴定及DNA测序分析,成功构建GV369-miR-637慢病毒表达载体质粒。GV369-miR-637-TPC-l和GV369-NC-TPC-1细胞在荧光显微镜下均发出绿色荧光,并且转染效率高。3、CCK-8实验结果显示稳定过表达miRNA-637后抑制TPC-1细胞的增殖能力;流式细胞仪分析细胞周期结果显示稳定过表达miRNA-637后TPC-1细胞G1期上升,S期下降;通过对转染后细胞凋亡情况进行检测发现,稳定过表达miRNA-637促进细胞的凋亡;划痕实验和细胞迁移实验结果说明稳定过表达miRNA-637的TPC-1细胞的迁移运动能力明显减弱。4、我们分别检测转染组、对照组和空白组细胞中PI3K-AKT3-mTOR信号通路的关键蛋白AKT3的表达,结果显示转染组AKT3蛋白表达降低,说明甲状腺乳头状癌细胞中miR-637的过表达抑制了 PI3K-AKT3-mTOR信号通路。敲除TPC-1细胞的AKT3基因后,利用划痕实验和transwell小室侵袭实验检测发现TPC-1细胞的侵袭迁移能力下降。结论1、MiR-637可能在甲状腺乳头状癌的发生发展过程中发挥重要作用,在甲状腺乳头状癌组织标本中miRNA-637和AKT3蛋白的表达呈负相关,提示两者可共同参与了甲状腺癌的发生发展。2、慢病毒可以感染TPC-1细胞系,并且可以在TPC-1细胞中稳定过表达。3、通过慢病毒介导过表达miR-637的TPC-1细胞,转染后TPC-1细胞的生物学行为受到抑制,进一步证实miRNA-637具有抑癌基因作用。4、AKT3是miR-637的靶基因,miR-637在mRNA和蛋白质水平调控AKT3表达,沉默AKT3后TPC-1细胞侵袭和迁移能力下降,说明了 PI3K-AKT3-mTOR信号通路介导了 MiRNA-637对甲状腺乳头状癌细胞侵袭迁移能力的影响,并为基因靶向治疗降低甲状腺乳头状癌侵袭转移提供理论基础。