论文部分内容阅读
石斛属(Dendrobium Sw.)是兰科(Orchidaceae)中第二大属,全世界约有1500种,主要分布在亚洲的热带,亚热带和北美洲。许多世纪以来石斛属植物被用作传统的药用植物。现代药理研究表明,石斛属植物有多种药理作用,如抗癌,抗氧化,免疫调节,与血管舒张功能的影响。然而多数石斛植物分布地域虽然广泛却生长在相对狭隘的小气候生境,具有较显著的生态多样性。由于其具有很高的药用价值和园艺观赏,目前在市场上进行大量交易,导致石斛属植物资源处于濒危状态,因此加快并深入对石斛的研究和保护工作是当务之急。分子标记技术能从DNA水平上反映物种的遗传差异,是研究遗传多样性的有效方法。ISSF分子标记技术具有简便、快速、稳定性好、无种属特异性等优点,广泛应用于遗传多样性研究。本研究以福建农林大学茶叶科技与经济研究所石斛的30个属命名种为研究对象,采用ISSR分子标记方法,对其遗传多样性以及亲缘关系进行研究。该研究不仅有利于今后的种质资源保护,还对杂交育种亲本的选择具有重要的指导作用。铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall. ex Lindl.)作为药用石斛之上品,是资源最为缺乏的一种。在进行铁皮石斛化学成分的研究中,发现其主要的药效成分为多糖,具有较高的开发价值。本研究采用响应曲面法对其提取温度、料液比、提取时间、提取次数进行工艺优化,为今后石斛多糖的提取工艺提供依据和参考,并为石斛多糖的深入研究奠定基础。本研究主要结果如下：(1)采用单因素多水平法进行试验设计,对模板DNA、dNTP、100×PCR Buffer、引物、Taq DNA聚合酶这5个因素进行体系优化,建立了石斛的ISSR-PCR扩增体系,结果为：在20μL反应体系中,模板DNA (10 ng·uL-1) 3 μL, dNTP (2.5 mmol·L-1) 1.5μL,10×PCR Buffer 3.0μL,引物(4μmol·L-1) 3.5 μL, Taq DNA聚合酶(5U·μL-1) 0.2 μL, ddH2O8.8μL。(2)从20条ISSR引物中筛选出7条扩增清晰的引物,之后对30个石斛品种进行遗传多样性分析,共扩增52条清晰的条带,其中多态性条带30个,占总条带的57.7%,每个引物平均扩增出7.4个条带。(3)根据ISSR-PCR扩增结果,利用Ntsys软件计算出遗传相似系数,其范围在0.60～0.93。按UPGMA聚类法对30个石斛品种进行聚类分析,其结果将供试材料分为两大组,5号样品明显与其它29种石斛亲缘关系最远；1号样品和21号样品亲缘关系较近；3号样品和8号样品亲缘关系较近；10号样品和19号样品亲缘关系较近；26号样品和28号样品亲缘关系较近。(4)采用水提醇沉法,在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken试验设计方法,对提取温度、料液比、提取时间和提取次数4个因素的3个水平进行响应曲面分析,建立了影响铁皮石斛多糖提取的二次方程模型,方程为：Y=14.03+1.05A+1.25B+0.12C+0.76D-0.29AB+0.34AC-0.098AD+0.21BC-0.20BD+0.29CD-0.94A2-0.76B2-0.64C2-0.22D2。根据试验数据分析,得到各因素对铁皮石斛多糖提取影响顺序：料液比(B)>提取温度(A)>提取次数(D)>提取时间(C)。铁皮石斛多糖的最优提取工艺条件：提取温度85℃,料液比1：37,提取时间2.3 h,提取次数4次。在此工艺条件下,铁皮石斛多糖的提取率可达14.98%。