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研究目的利用前列腺癌肿瘤相关成纤维细胞(CAF)与正常成纤维细胞(NF)分泌的exosome分别处理肿瘤细胞,初步探讨CAF来源的exosome及其所含的特定生物分子在前列腺癌细胞发生上皮间充质转化(EMT)中的作用。研究方法(1)利用Western Blot和细胞免疫荧光(IF)的方法鉴定CAF与NF,并提取CAF与NF的条件培养基处理前列腺肿瘤细胞,Western Blot验证不同培养基对肿瘤细胞的影响。(2)利用超高速梯度离心技术提取CAF与NF条件培养基中的exosome,并使用透射电子显微镜对其进行鉴定。(3)利用PKH-67对CAF及NF分泌exosome进行染色,IF下观察肿瘤细胞对exosome的摄取情况。(4)利用Transwell migration assay,Western Blot和IF分析exosome对前列腺肿瘤细胞迁移作用及EMT的影响。(5)查阅相关文献及数据库,初步鉴定可能引起上述作用的mi RNA,利用RT-PCR及q PCR进行分析及定量,利用mi RNA抑制剂处理CAF及NF后重复上述实验,并通过Transwell migration assay,Western Blot和IF对结果进行验证。研究结果(1)利用前列腺癌细胞自身的条件培养基作对照,NF及CAF的条件培养基作为处理组分别作用于Tramp-C1和LNCa P细胞,Western Blot检测显示与肿瘤细胞自身条件培养基和NF条件培养基相比,CAF的条件培养基可促进肿瘤细胞发生EMT转化。(2)利用梯度超速离心法提取了NF和CAF细胞的exosome,经Western Blot和透射电子显微镜成功验证。Exosomo经PKH-67染色后行IF检查,发现上述exosome可被前列腺肿瘤细胞吸收,吸收了CAF exosome的肿瘤细胞迁移能力增强,同时发生了EMT转化。(3)通过文献及数据库我们找出了4种潜在的可能引起该作用的mi RNA,分别是mi RNA-18a、mi RNA-21、mi RNA-181ba和mi RNA-214。通过PCR、q RT-PCR等方法发现mi RNA-18a和mi RNA-21在NF和CAF来源的exosome中表达量具有统计学差异,且该差异可经exosome传递进Tramp-C1和LNCa P细胞中。使用mi RNA inhibitor和NC等物质处理CAF细胞后,最终发现mi RNA-21是CAF来源的exosome促肿瘤细胞EMT转化的主要mi RNA。抑制该mi RNA后,前列腺肿瘤细胞迁移能力下降,EMT转化作用被逆转。(4)CAF细胞促进前列腺癌细胞EMT转化是由多种成分参与的复杂过程,我们的研究表明含有mi RNA-21的exosome参与了该过程,但是CAF条件培养基中还有其他物质参与,具体成分尚不明确。研究结论CAF能够促进前列腺肿瘤细胞发生EMT转化,该作用可通过其分泌的exosome中mi RNA-21实现,抑制mi RNA-21后,上述结果被逆转。