目的探讨癌症患者外周血中CD4⁺CD25⁺调节性T（regulatory T，Treg）细胞的变化及其机制；体外表达hGITRL并制备特异性单克隆抗体，为进一步研究GITRL-GITR（glucocorticoid-induced TNF receptor）信号转导途径干预Treg细胞的免疫抑制功能奠定基础。方法（1）通过流式细胞仪（flow cytometry，FCM）技术检测癌症患者外周血CD4⁺CD25⁺ T细胞及CD8⁺ T细胞、CD16⁺CD56⁺NK细胞亚群比例。（2）利用癌症患者恶性胸水（5例）体外培养CD4⁺CD25^-T细胞，并通过RT-PCR检测被诱导细胞的FOXP3基因表达，FCM动态检测CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ T细胞比例，淋巴细胞增殖试验和抑制试验鉴定诱导性CD4⁺CD25⁺ T细胞的生物学功能。（3）采用RT-PCR方法，从人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中获得hGITRL（human hGITRL）基因，并克隆至pMD-18T载体，选择阳性克隆进行酶切鉴定和序列测定。（4）从全长质粒hGITRL-pMD-18T中扩增hGITRL胞外段(hGITRL_{（aa52～177）})，克隆至表达载体pQE30；将阳性重组质粒转化至大肠杆菌M15，IPTG诱导蛋白表达；表达蛋白用Ni²⁺-IMAC柱纯化、复性并通过Western blot进行鉴定，FCM检测hGITRL_{（aa52～177）}重组蛋白与活化淋巴细胞上GITR的结合能力，淋巴细胞增殖试验分析其生物学活性。（5）重组hGITRL_{（aa52～177）}免疫Balb／c小鼠，通过细胞融合和克隆技术，筛选分泌获得抗GITRL抗体的杂交瘤细胞株，并通过ELISA、Western blot和FCM对单克隆抗体进行鉴定。结果（1）与健康对照组（n=30，4.7±1.2％）相比，癌症患者治疗前（n=56，12.4±5.6％）与治疗后（n=72，11.2±5.2％）CD4⁺CD25⁺ T细胞比例均明显升高，但治疗前与治疗后组间无明显差异；鳞癌（n=33，11.4±5.6％）与腺癌（n=45，12.5±5.8％）患者CD4⁺CD25⁺ T细胞比例无明显差别。（2）在恶性胸水诱导下，FCM显示有12.5±3.4％的CD4⁺CD25^-T细胞可转化为CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ T细胞，RT-PCR证实这些被诱导的CD4⁺CD25^- T细胞有FOXP3基因mRNA表达。诱导性CD4⁺CD25⁺ T细胞在抗CD3 mAb（1μg／ml）和IL-2（50U／ml）的刺激下不发生增殖，并能抑制CD4⁺CD25^- T细胞的增殖和IFN-γ的分泌。（3）成功克隆hGITRL基因，其编码区为534bp，编码177个氨基酸残基，与GenBank中公布的序列完全一致。（4）成功构建了hGITRL_{（aa52～177）}-pQE30原核表达载体，表达相对分子质量约15KD的重组蛋白。该蛋白能与活化淋巴细胞膜上受体GITR结合，低浓度时能促进淋巴细胞的增殖，而在高浓度时则抑制了淋巴细胞的增殖。（5）获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株（Dd9和Dh8）。两株单克隆抗体识别不同的抗原表位，其腹水效价分别为1：1.5×10⁶（Dd9）和1：2×10⁶（Dh8）。Western blot及FCM显示这两株抗体分别能与重组hGITRL和HUVEC膜上GITR发生结合。结论（1）癌症患者外周血CD4⁺CD25⁺ T细胞比例明显增多，恶性胸水具有诱导分化CD4⁺CD25^- T细胞表达FOXP3基因的能力，提示癌症患者CD4⁺CD25⁺ Treg细胞比例增多源于肿瘤因素。（2）获得hGITRL基因质粒并成功表达了具有生物学活性的hGITRL_{（aa52～177）}重组蛋白，GITR-GITRL相互作用对调节淋巴细胞的增殖具有重要作用。（3）成功制备了抗hGITRL单克隆抗体，为进一步研究hGITRL在免疫应答中的作用及与疾病的关系奠定了基础。