本课题选择上海市4家医院的中央空调冷却水为研究对象，通过军团菌和自由生活阿米巴的分离培养和两者共培养的方法对外环境中军团菌和自由生活阿米巴的分布进行流行病学研究，同时在实验室条件下对两者进行共培养，并观察军团菌在共培前后的改变。 本研究的目的是为了了解上述四家医院军团菌在中央空调冷却水中的污染情况，和军团菌与同环境中自由生活阿米巴分布上的关系，以及两者之间在生态学上的关系。本研究还期望通过两者的共培养来探讨自由生活阿米巴对军团菌在传播和表型上的影响。为我国军团菌的预防和控制提供生态学的依据。本课题研究包括4部分： 一、军团菌与同一空调水环境中自由生活阿米巴的分离 通过对中央空调冷却水中军团菌和自由生活阿米巴的分离，了解军团菌的污染情况，描述两者之间分布上的关系。本研究于上海市4家医院的空调系统中采水样，应用分离培养的方法进行军团菌和自由生活阿米巴的分离。军团菌最终进行血清学分型。研究结果表明，中央空调冷却水中军团菌检出率较高，达52．17％，型别主要是嗜肺军团菌9型，其次为1型，3型和6型。6～9月份各月检出率各不相同，最低为33．3％，最高为70％，检出率跟各月采样时点前后气温的关系比较密切。自由生活阿米巴的检出率69．56％。自由生活阿米巴阳性的水样中分离出军团菌的水样为53．1％，阿米巴阴性水样中分离出军团菌的水样为50％，两者差异之间无统计学意义。冷却水中阿米巴前后检出的变化与军团菌的变化之间表现出一定的一致性，变化一致的有10例，变化相反的仅有4例。 该部分结果显示，中央空调冷却水中军团菌污染相当普遍。军团菌在水中的分布与气温有一定的关系，与阿米巴的分布也有一定的相关性。 二、军团菌与同一空调环境中分离到的自由生活阿米巴的共培养实验 军团菌与自由生活阿米巴分别分离自同一份水样中，将两者纯化培养后，于实验室条件下进行共培养。将共培养产物Gimenes染色后油镜下观察，并将产物于电镜下观察。共培养8h后，阿米巴胞内空泡增加，个别阿米巴空泡内可观察到有军团菌的出现。24h后可观察到阿米巴胞内的军团菌数量增加，大部分胞内可观察到军团菌，阿米巴结构仍保持完整。72～96h后，阿米巴变圆，数量减少，胞内军团菌成团存在，有阿米巴细胞体裂解，阿米巴残骸周围散布存在着大量军团菌。计数显示，共培养后阿米巴的数量明显减少。电镜照片同样显示了上述变化，阿米巴胞内存在大量成熟的军团菌菌体，可见到有二分裂形态的存在。并且在被吞噬入阿米巴胞内的军团菌周围发现了年轮状的层层环绕的膜结构。 该实验提示，同一环境中军团菌可以在自由生活阿米巴体内存活，并进行分裂繁殖，两者之间是寄生与被寄生的关系，条件合适的时候阿米巴的命运是被军团菌裂解。另外，阿米巴吞噬军团菌采用的是包括缠绕吞噬在内的两种或者多种吞噬方式。 三、军团菌与自由生活阿米巴关系的探讨 将军团菌与阿米巴共培养，染色观察共培养前后军团菌形态上的改变，利用SDS-PAGE电泳考察军团菌菌体蛋白的改变。不同温度条件下共培养时，通过对阿米巴的计数来考察军团菌对自由生活阿米巴作用的差别。 共培养前后军团菌形态上发生了改变，由原来的长丝状的菌体转变为短杆状的菌体。实验结果表明，该改变是在阿米巴体内完成的，因为长丝状的菌体也可以被阿米巴吞噬进入胞内，而不是有选择性的只吞食短小的菌体。 但是SDS—PAGE蛋白电泳并没有显示前后有新的蛋白产生或者有原有蛋白的减少。相同温度下，对照组的阿米巴浓度较对照组高，进一步证实了，军团菌对阿米巴的裂解作用。 另外，对照组不同温度下的比较显示，温度越高阿米巴的浓度反而越低，这说明阿米巴更适合在相对较低的温度下生长。而共培养组也显示出相同的趋势，说明军团菌在较高的温度下(35℃)对阿米巴的裂解能力更强。 四、阿米巴活体微培养法的创建 为能观察到活体吞噬的全过程，并阐明被吞噬微生物和自由生活阿米巴的消长过程，本实验摸索出一种在普通光学显微镜油镜下可连续观察自由生活阿米巴活体形态及其运动过程的微量悬滴培养法。该方法可在油镜下连续观察不经染色的滋养体各种活动以及吞噬异物的过程。滋养体形态伸展贴于盖玻片上，胞体向外伸出，在玻片上作阿米巴运动，圆形细胞核及外膜边缘的棘突清晰可见，并观察到滋养体分裂的全过程。该方法可用于教学和研究上。