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目的:研究HP-HA-下颌下腺特异性细胞外基质的制备方法,探讨自制基质的结构及生物学特征。
方法:①采用物理(冻融、机械震荡)及化学(SDS、TritonX-100表面活性剂)相结合方法制备下颌下腺细胞外基质(ECM);
②采用苏木精和伊红染色、4,6-二氨基-2-苯基吲哚染色对下颌下腺脱细胞效果进行评价;
③采用免疫组化及酶联免疫吸附方法评估正常下颌下腺及下颌下腺细胞外基质中脱氧核糖核酸、生长因子、粘多糖、蛋白的情况及下颌下腺基质中上述成分的保留情况;
④利用扫描电镜观察下颌下腺细胞外基质、HP-HA-下颌下腺特异性细胞外基质(肝素-透明质酸-下颌下腺特异性细胞外基质水凝胶)表面结构;
⑤酶联免疫吸附方法检测HP-HA-下颌下腺特异性细胞外基质为期一周生物活性因子缓释变化。
结果:
①下颌下腺细胞外基质外观呈白色透明状,大体形态保留完整;
②组织学观察:正常下颌下腺可见深染细胞核及胞质,而下颌下腺细胞外基质未见细胞核及细胞质,可见基质纤维交错排列呈网状结构;
③免疫组织化学染色可见下颌下腺细胞外基质主要蛋白均呈阳性表达;
④下颌下腺细胞外基质中DNA含量较脱细胞前下降94.6%,差异具有统计学意义(P<0.0001),生长因子(EGF、VEGF、bFGF、IGF)有少量下降,但幅度不是很明显,差异无统计学意义(P>0.05),糖胺聚糖、弹性蛋白、总胶原蛋白均有不同程度下降,差异具有统计学意义(P<0.01);
⑤扫描电镜观察下颌下腺细胞外基质:纤维结构间未见细胞残留,HP-HA-下颌下腺特异性细胞外基质可见纤维结构交错排列;
⑥HP-HA-下颌下腺特异性细胞外基质生物活性因子为期一周缓释量:一周内因子均有不同程度的缓释量,第二天有不同程度的上升趋势,随后下降趋于平稳,第七天仍存在不同的浓度缓释量,分别为90.93pg/ml(EGF)、83.11pg/ml(bFGF)、98.45pg/ml(VEGF)、80.89pg/ml(IGF)。
结论:
本研究制备的HP-HA-下颌下腺特异性细胞外基质具有生物因子缓释作用,为下一步细胞培养和3D类器官的研究打下基础。
方法:①采用物理(冻融、机械震荡)及化学(SDS、TritonX-100表面活性剂)相结合方法制备下颌下腺细胞外基质(ECM);
②采用苏木精和伊红染色、4,6-二氨基-2-苯基吲哚染色对下颌下腺脱细胞效果进行评价;
③采用免疫组化及酶联免疫吸附方法评估正常下颌下腺及下颌下腺细胞外基质中脱氧核糖核酸、生长因子、粘多糖、蛋白的情况及下颌下腺基质中上述成分的保留情况;
④利用扫描电镜观察下颌下腺细胞外基质、HP-HA-下颌下腺特异性细胞外基质(肝素-透明质酸-下颌下腺特异性细胞外基质水凝胶)表面结构;
⑤酶联免疫吸附方法检测HP-HA-下颌下腺特异性细胞外基质为期一周生物活性因子缓释变化。
结果:
①下颌下腺细胞外基质外观呈白色透明状,大体形态保留完整;
②组织学观察:正常下颌下腺可见深染细胞核及胞质,而下颌下腺细胞外基质未见细胞核及细胞质,可见基质纤维交错排列呈网状结构;
③免疫组织化学染色可见下颌下腺细胞外基质主要蛋白均呈阳性表达;
④下颌下腺细胞外基质中DNA含量较脱细胞前下降94.6%,差异具有统计学意义(P<0.0001),生长因子(EGF、VEGF、bFGF、IGF)有少量下降,但幅度不是很明显,差异无统计学意义(P>0.05),糖胺聚糖、弹性蛋白、总胶原蛋白均有不同程度下降,差异具有统计学意义(P<0.01);
⑤扫描电镜观察下颌下腺细胞外基质:纤维结构间未见细胞残留,HP-HA-下颌下腺特异性细胞外基质可见纤维结构交错排列;
⑥HP-HA-下颌下腺特异性细胞外基质生物活性因子为期一周缓释量:一周内因子均有不同程度的缓释量,第二天有不同程度的上升趋势,随后下降趋于平稳,第七天仍存在不同的浓度缓释量,分别为90.93pg/ml(EGF)、83.11pg/ml(bFGF)、98.45pg/ml(VEGF)、80.89pg/ml(IGF)。
结论:
本研究制备的HP-HA-下颌下腺特异性细胞外基质具有生物因子缓释作用,为下一步细胞培养和3D类器官的研究打下基础。