研究背景:2型糖尿病是遗传因素和环境因素长期作用的结果,胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足（包括两者的相互作用）是目前公认的2型糖尿病发病机制的两个基本环节和特征。当前这方面的研究主要集中于高血糖、高血脂对胰岛功能的影响,而高浓度氨基酸对胰岛功能的影响则研究很少。目前亮氨酸对胰岛功能的影响尤其是对葡萄糖刺激的胰岛素释放的作用,这方面的研究很多,但是存在着很大的争议。Yang等发现亮氨酸可以促进葡萄糖刺激的胰岛素释放,然而Anello等则在他们的实验中发现长期亮氨酸以剂量依赖方式抑制葡萄糖刺激的胰岛素释放。并且,到目前为止,亮氨酸影响胰岛素释放和胰岛素含量的具体机制也尚未阐明。PDX-1（Pancreas/Duodenum Homeobox-1）,即胰腺十二指肠同源异型盒因子-1,是胰腺β细胞胰岛素基因的转录调控因子,此外,PDX-1还能转录胰岛素和调控胰岛素相关基因如葡萄糖转运蛋白2（GLUT-2）和葡萄糖激酶（GCK）等的表达,对胰岛细胞内分泌功能起重要调节作用。而葡萄糖刺激β细胞释放胰岛素,首先必须经细胞膜上GLUT-2蛋白转运进入细胞内,在葡萄糖激酶作用下磷酸化,增加ATP/ADP比值,使胰岛素颗粒释放。大量实验研究显示PDX-1与胰岛素分泌具有密切的关系,那么他们是否在亮氨酸影响胰岛功能的过程中发挥作用是我们研究的方向。因此,我们的实验旨在研究长期高浓度亮氨酸培养对葡萄糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量的影响,并且进一步研究其相关机制。目的:1.观察长期亮氨酸培养对大鼠胰岛β细胞株（DN-PDX-1# 28和PDX-1# 6）的胰岛素释放功能和胰岛素含量的影响。2.观察长期亮氨酸对DN-PDX-1# 28和PDX-1# 6细胞中PDX-1、GCK/GLUT2mRNA表达的影响,探讨可能的机制。3.观察长期亮氨酸是否通过（PDX-1）-（GCK/GLUT2）通路影响高糖刺激的胰岛素释放以及胰岛素含量。研究方法:1.DN-PDX-1# 28和PDX-1# 6胰岛细胞株的培养和分组:RPMI1640培养PDX-1#6细胞株与PDX-1不表达的PDX-1#28细胞,加以强力霉素（Doxycyline）,使PDX-1过表达以及不表达。DN-PDX-1#28 and PDX-1#6细胞在RPMI1640培养基中培养,此外,还需添加100μg/ml潮霉素,100μg/ml G418和500 ng/ml的强力霉素。DN-PDX-1#28和PDX-1#6细胞分别在40mM亮氨酸或者500 ng/ml的强力霉素中培养。处理时间:48小时。2.葡萄糖刺激的胰岛素释放功能以及胰岛素含量的测定与评价:细胞种于24孔板中,分组处理后,在葡萄糖浓度为3.3 mM、27.8 mM的KRB缓冲液分别孵育20min,收集上清,放射免疫方法测定分泌的胰岛素水平分别为基础胰岛素分泌（BIS）和葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）。3.PDX-1、GCK、GLUT2的mRNA检测:在DN-PDX-1#28和PDX-1#6细胞上,Real-time PCR检测PDX-1、GCK、GLUT2mRNA的表达。结果:1、胰岛素释放和胰岛素含量①在DN-PDX-1# 28细胞中,与正常对照组相比,单纯亮氨酸组和单纯强力霉素组分别显著降低高糖刺激的胰岛素分泌36%和84%（P＜0.05）,分别降低胰岛素含量23%和62%（P＜0.05）。与单纯亮氨酸组相比,强力霉素与亮氨酸共同培养组显著降低高糖刺激的胰岛素分泌67%（P＜0.05）,降低胰岛素含量44%（P＜0.05）。②在PDX-1# 6细胞中,与正常对照组相比,单纯亮氨酸组显著降低高糖刺激的胰岛素分泌26%（P＜0.05）,降低胰岛素含量25%（P＜0.05）;单纯强力霉素组显著增加高糖刺激的胰岛素分泌20%（P＜0.05）,增加胰岛素含量21%（P＜0.05）。然而,与单纯亮氨酸组相比,强力霉素与亮氨酸共同培养组显著增加高糖刺激的胰岛素分泌36%（P＜0.05）,增加胰岛素含量21%（P＜0.05）。2、PDX-1、GCK、GLUT2mRNA表达①在DN-PDX-1#28细胞中,与对照组相比,单纯亮氨酸组显著降低PDX-1、GCKmRNA和GLUT2 mRNA水平（P＜0.05）;单纯强力霉素组也显著降低PDX-1、GCK mRNA和GLUT2 mRNA水平（P＜0.05）;与单纯亮氨酸组相比,强力霉素与亮氨酸共同培养组显著降低PDX-1、GCK mRNA和GLUT2 mRNA水平（P＜0.05）。②在PDX-1# 6细胞中,与对照组相比,单纯亮氨酸组显著降低PDX-1、GCKmRNA和GLUT2 mRNA水平（P＜0.05）;单纯强力霉素组也显著增强PDX-1、GCK mRNA和GLUT2 mRNA水平（P＜0.05）;与单纯亮氨酸组相比,强力霉素与亮氨酸共同培养组显著增强PDX-1、GCK mRNA和GLUT2 mRNA水平（P＜0.05）。结论:长期40mM浓度亮氨酸在转录水平通过降调β细胞PDX-1以及其下游因子GCK与GLUT2 mRNA表达,最终抑制高糖刺激的胰岛素释放以及胰岛素含量。研究背景:在甲状腺疾病的发生发展过程中,生长因子的作用日益受到重视,其中以血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的作用较为突出。生长因子以内分泌、旁分泌和自分泌等方式,广泛而精细的地调节甲状腺细胞的生长、分化和功能,参与甲状腺疾病的发生发展过程。VEGF是最强的可溶性血管形成因子之一,能增加微血管的通透性,促进血浆纤维蛋白外渗,为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络;并能直接刺激内皮细胞增殖,促进内皮细胞移动,利于血管形成。根据编码VEGF mRNA的剪接方式不同,即亚单位所含氨基酸数量的不同,至少分为5种亚型,即VEGF₂₀₆、VEGF₁₈₉、VEGF₁₆₅ VEGF₁₄₅及VEGF₁₂₁。在大鼠中VEGF的亚型也有类似的编码,但比人类的少一个氨基酸。IGF-1是一种多功能的生长因子,具有广泛的生物的生物学作用,能促进细胞的增殖和抑制细胞的凋亡,对血管内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞的增殖、分化、代谢有重要的促进作用。另外,在内分泌肿瘤细胞中,IGF-1可以上调VEGF的mRNA和蛋白表达,从而参与新生血管形成。我们前期研究结果显示,GD患者血清和甲状腺组织中的VEGF与GD患者甲状腺内血管形成有关,IGF-I还与GD患者甲状腺体积有关。其机制研究多限于GD患者甲状腺自身免疫性抗体模拟TSH作用于TSH受体而引起,但临床中也存在大量非自身免疫性甲状腺肿大合并高代谢患者,其发病机制尚不明确。因此探讨甲状腺血管增生性肿大的形成机制,研发有效的治疗方法是十分必要的。甲状腺的毒性症状表现在甲状腺激素（T3）引起的高代谢,嘌呤核苷酸循环增强,致ATP分解代谢增强,经过一系列代谢后生成小分子物质腺苷,并有研究报道甲状腺功能亢进患者血清腺苷浓度明显高与正常人群,而内源性腺苷的受体则为腺苷受体A2aR。腺苷受体属于G蛋白偶联受体家族,其中腺苷受体A2aR已经被发现在心肌细胞、免疫炎症细胞以及中枢神经细胞中有表达,尤其在中枢神经系统有大量表达。该受体在某些疾病中已经是潜在的调节新生血管形成的治疗靶点。先前的研究发现在不同的细胞中,腺苷受体A2aR对VEGF的影响是不尽相同的。早在1992年Ledent等第一次报道甲状腺肿大合并功能亢进的动物模型:腺苷受体A2转基因小鼠。这是腺苷受体在甲状腺的相关研究中第一次被关注。2003年和2004年国外研究发现:A2aR转基因模型同样可以引起高功能的甲状腺肿大,并且在这种转基因模型的甲状腺组织中,微血管主要位于增生区域,该区域VEGF蛋白的表达明显高于对照,并且IGF-1的mRNA表达也增高。故我们推测甲状腺肿大患者甲状腺局部腺苷水平的变化或者说其受体A2aR活性变化可能与甲状腺血管增生性肿大的发生发展有关。基于上述研究现状,为了更深入的认识A2aR在甲状腺中的表达及其对VEGF、IGF-1的影响,以便为发现治疗甲状腺血管增生性肿大的分子靶点提供实验依据,本研究确定研究目的与方法如下:目的:1、确定A2aR在大鼠甲状腺细胞中的基因和蛋白表达:2、通过A2aR激动剂或TSH刺激甲状腺细胞,观察A2aR和TSHR基因表达的变化,初步探讨A2aR和TSHR的关系;3、通过A2aR激动剂、A2aR阻断剂、TSH或IGF-1刺激甲状腺细胞,观察VEGF基因和细胞内外蛋白表达的变化;以及通过A2aR激动剂、A2aR阻断剂刺激甲状腺细胞,观察IGF-1基因和细胞内外蛋白表达的变化,探讨A2aR对VEGF和IGF-1影响。研究方法:1、甲状腺细胞（Fisher rat thyroid cell line-5,FRTL-5）培养:Coon’s改良的Ham’s F12培养液中加入六种激素-促甲状腺激素10 mU/ml、胰岛素10μg/ml、转铁蛋白5μg/ml、氢化考的松5 ng/ml、生长抑素10 ng/ml、甘氨酸-组氨酸-亮氨酸10 ng/ml及5%胎牛血清,即配成甲状腺细胞培养液,称为6H（hormome）。待甲状腺细胞在培养皿中长至80%～85%时,PBS洗两遍,然后以4H培养基（6H培养基去除促甲状腺激素和胰岛素,改为其余四种激素加0.2%胎牛血清）为对照加入不同的处理（A2aR激动剂CGS21680、A2aR阻断剂ZM241385、TSH或IGF-1）作用48小时。另外,原代培养的大鼠神经元细胞作为A2aRmRNA表达的阳性对照。2、采用RT-PCR检测A2aR、TSHR、IGF-1和VEGF各亚型mRNA水平变化。3、采用免疫荧光反应检测A2aR在甲状腺细胞中表达的位置。4、采用免疫沉淀-Western blot检测A2aR和IGF-1蛋白水平。5、采用酶联免疫吸附剂测定法检测甲状腺细胞内外VEGF蛋白水平。结果:1、A2aR在甲状腺细胞中的表达:在甲状腺细胞和阳性对照神经元细胞中都能扩增出A2aRmRNA140bp大小的片段。与正常对照组相比,1.0μM CGS21680能上调甲状腺细胞A2aR的mRNA水平（P＜0.05）,而10mU/ml TSH下调其mRNA水平（P＜0.05）;采用了免疫共沉淀-Western blots的方法进行半定量实验结果显示在甲状腺细胞中CGS21680可以轻度调节A2aR蛋白水平（P＞0.05）,采用了免疫荧光的方法进行定位实验结果显示A2aR蛋白表达在甲状腺细胞的细胞膜中。2、TSHR在甲状腺细胞中的mRNA的表达:与正常对照组相比,10 mU/mlTSH下调30.5%（P＜0.05）,而1.0μM CGS21680上调1.35倍（P＜0.05）甲状腺细胞TSHR的mRNA水平,并且都呈剂量依赖性。3、VEGF各亚型在甲状腺细胞中的转录表达:正常培养甲状腺细胞中可以扩增出4个VEGF亚型:VEGF₁₈₈,VEGF₁₆₄,VEGF₁₄₄和VEGF₁₂₀,其中,VEGF₁₂₀和VEGF₁₆₄是主要成分。CGS21680对VEGF亚型mRNA的影响:与正常对照组相比,CGS21680明显上调VEGF₁₈₈和VEGF₁₆₄的表达（P＜0.05）;TSH对VEGF亚型mRNA的影响:与正常对照组相比,TSH明显下调VEGF₁₈₈和VEGF₁₆₄的表达（P＜0.05）;IGF-1对VEGF亚型mRNA的影响:与正常对照组相比,IGF-1明显上调VEGF₁₆₄和VEGF₁₂₀的表达（P＜0.05）。4、VEGF蛋白在甲状腺细胞中的表达:①首先对细胞内外的VEGF蛋白量进行相关分析:VEGF蛋白量细胞外量是细胞内量的22.3倍,相关分析显示两者之间呈正相关关系,相关系数为0.978。②A2aR对VEGF蛋白表达的影响:CGS21680刺激甲状腺细胞后,细胞内外VEGF蛋白含量都明显增加,且随着CGS21680刺激浓度的增高;相反,ZM241385刺激甲状腺细胞后,细胞内外VEGF蛋白含量都明显下调,且随着ZM241385刺激浓度的增高,VEGF表达明显下调;ZM241385可以抑制CGS21680引起的VEGF上调表达。以上说明VEGF的蛋白表达与A2aR的活性变化呈剂量依赖性;③TSH和IGF-1对VEGF蛋白表达的影响:加入10 mU/ml TSH后,与对照组相比,细胞外VEGF含量下降16.9%（P＜0.05）;而加入50ng/ml IGF-1后,细胞外VEGF含量升高39.0%（P＜0.05）。5、TSH和A2aR对IGF-1的影响:加入10 mU/ml TSH后,IGF-1mRNA水平下调。而A2aR激动剂CGS21680刺激甲状腺细胞后,与对照组相比,IGF-1 mRNA和蛋白水平上调,阻断剂ZM241385可以抑制IGF-1蛋白水平。结论:1、腺苷受体A2aR在甲状腺细胞FRTL-5中存在mRNA和蛋白的表达,并且该受体蛋白表达在细胞膜中。2、腺苷受体A2aR的激动剂CGS21680上调甲状腺细胞A2aR、TSHR、VEGF亚型(主要是VEGF₁₆₄)和IGF-1mRNA水平的表达;相反TSH受体的配体TSH下调以上三个基因的mRNA水平表达。本研究结果表明,同为G蛋白偶联受体的A2aR和TSHR之间可能存在某种协同关联。3、A2aR调节甲状腺细胞VEGF和IGF-1的mRNA和蛋白水平的表达;IGF-1上调甲状腺细胞VEGF的mRNA(主要是VEGF₁₆₄)和蛋白水平的表达,这提示在甲状腺细胞内A2aR上调VEGF表达可能与IGF-1参与有关。本研究结果表明A2aR可能通过上调VEGF和IGF-1而参与甲状腺血管增生性肿大的形成。