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本研究以一株产猪干扰素（pIFN-α）的重组毕赤酵母为实验菌株，在5L发酵罐上进行细胞高密度培养、生产表达pIFN-α蛋白。但是，毕赤酵母生产pIFN-α发酵过程性能不稳定，即便诱导开始时的细胞浓度完全相同，诱导条件（甲醇浓度、溶解氧浓度DO等）也相同，pIFN-α蛋白的抗病毒活性有时会相差很大。为了解决上述问题，本论文利用发酵过程控制的方法和手段，重点研究了甘油流加培养期内不同的甘油流加控制策略，旨在提高pIFN-α的表达水平、稳定发酵性能。主要结果总结如下：1）研究发现，使用传统DO-Stat法流加甘油，在培养末期、细胞浓度达到一定水平（80-100g-DCW L–1）后，乙醇开始积累。乙醇积累的开始时间和最高浓度随流加培养的条件状况而变，不易控制。细胞如果长时间地（4h）处在高浓度的乙醇（6g·L–1）环境，甲醇诱导无法启动。诱导开始后，DO和耗氧速度（OUR）长时间（16h）地在100%和0的水平上徘徊。但是，积累的乙醇可以被完全吸收消耗。2）通过分析测定甲醇代谢途径的几个关键酶基因的转录水平及其酶活发现，培养期内乙醇高浓度、长时间的积累不可逆转地抑制了醇氧化酶（AOX）的活性和基因转录水平，这是甲醇诱导无法启动，pIFN-α发酵生产不稳定的最主要原因。3）商业化甲醇电极既可以用来在线测量甘油流加培养期内的乙醇浓度，又可以在线测量甲醇诱导期内的甲醇浓度。为此，提出了基于乙醇在线测量的改良型甘油流加控制策略，该策略可以同时利用甘油和积累的乙醇，将乙醇浓度控制在任意水平。控制乙醇浓度在低水平（约2g·L–1）时，无论诱导条件（甲醇/山梨醇共混流加比1:1或4:1）如何，pIFN-α浓度均可稳定在2.70-3.65g L–1的高水平，比无乙醇浓度控制发酵批次的最高pIFN-α浓度提高29.0%以上；而控制乙醇浓度在高水平（约12g·L–1）时，pIFN-α浓度均停留在0.22-0.32g L–1的低水平。控制乙醇浓度可以稳定pIFN-α发酵性能得到了进一步的实验验证。4）进入到甲醇诱导阶段，甲醇浓度、DO、细胞密度等也是影响外源蛋白表达性能的关键因子。对于本论文所用菌种而言，只要甲醇诱导强度适中（约5g·L–1），低溶氧（DO≈0）环境反而有利于提高传氧推动力KLa（DO*-DO）、增加pIFN-α的表达水平。上述特征还可以缓解供氧压力、进一步改善整体发酵性能。