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研究背景及目的:脊髓损伤即由于各个因素所造成的该结构损伤,引起暂时性或永久性的功能障碍。临床中主要表现为在损伤区域水平以下,肌力减退、感觉障碍、以及部分脊髓调控的自主神经功能异常。尽管对于脊髓损伤的认识及研究不断深入,脊髓损伤仍是一种主要的致残性疾病,且治疗方式局限。胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)是由肠道L细胞分泌的促胰岛素分泌激素。利拉鲁肽是与天然人GLP-1具有高度序列一致性的长效药物。近期研究表明GLP-1的药物不仅降糖疗效确切,而且在多种中枢神经系统疾病中,例如阿尔兹海默病、帕金森病等,利拉鲁肽均具有潜在的营养和保护神经效果。自噬是将细胞内受损、变形、衰老或失去功能的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体,并进行消化和降解的过程。其在维持细胞自我调节,清除有毒物质,及细胞器回收中具有重要意义。研究表明,自噬作为一种促生存机制,通过调控神经细胞死亡,在中枢神经系统中起神经保护作用。这种保护作用在中枢神经系统退行性疾病及中枢神经创伤性疾病中均可被活化。本研究拟从自噬角度,探究GLP-1R激动剂利拉鲁肽对脊髓损伤的潜在神经保护作用,并进一步探究其潜在的信号通路激活机制。为临床治疗提供新的可能的治疗靶点,同时深化对脊髓损伤及神经元自噬反应关系的理解。研究方法:本项研究选择成年健康的Sprague–Dawley(SD)大鼠作为研究对象,体重220–240克。第一部分:探究利拉鲁肽对于脊髓损伤后神经功能恢复及自噬反应的影响。以Allen’s法为基础,采用改良的重物下落打击器,建立撞击性脊髓损伤大鼠模型。致伤能量以重量为10g,直径2mm撞击器,从20mm高度处下落至脊髓。以出现后肢抽动、后肢瘫痪、出现摇尾反射作为脊髓损伤模型建立成功的依据。将实验动物随机分为三组,分别为:假手术组(大鼠仅进行椎板切除手术,无脊髓损伤)、脊髓损伤组(大鼠建立脊髓损伤)、脊髓损伤+利拉鲁肽组(大鼠建立脊髓损伤模型,并应用利拉鲁肽进行干预)。其中利拉鲁肽干预组中,利拉鲁肽以200μg/kg剂量,于脊髓损伤术后立即行皮下注射,并于造模术后第1、2天重复给药。其余大鼠均给予同等剂量的无菌PBS缓冲液。各组SD大鼠分别于造模术后第特定时间点,应用Basso,Beattie,and Bresnahan评分系统对后肢运动功能进行评估。应用HE染色,观察并分析脊髓损伤造模术后28天脊髓组织坏死空洞的面积。应用Nissl染色,计数脊髓损伤后28天脊髓前角运动神经元数量。Western blot技术检测术后3天脊髓组织自噬标志蛋白LC3B、Beclin-1、p62蛋白表达情况,并应用免疫荧光双染进一步观察相关自噬标志蛋白在脊髓中的分布。第二部分:进一步探究利拉鲁肽神经保护作用的信号通路机制。加入AMPK信号通路抑制剂研究,因而将实验动物随机分为四组,分别为:假手术组、脊髓损伤组、脊髓损伤+利拉鲁肽组、脊髓损伤+利拉鲁肽+Compound C组(大鼠建立脊髓损伤模型后,同时应用利拉鲁肽及Compound C进行干预)。在利拉鲁肽与Compound C联合干预组中,大鼠于脊髓损伤后立即给予利拉鲁肽200μg/kg皮下注射,以及Compound C 20mg/kg腹腔注射,并同样于造模术后第1、2天重复给药。其余各组处理方式同前。应用Basso,Beattie,and Bresnahan评分系统对后肢运动功能进行评估。应用HE染色,观察并分析脊髓损伤造模术后28天脊髓组织坏死空洞的面积。应用Nissl染色,计数脊髓损伤后28天脊髓前角运动神经元数量。Western blot技术检测术后3天脊髓组织自噬标志蛋白LC3B、Beclin-1、p62蛋白表达情况,应用免疫荧光双染进一步观察相关自噬标志蛋白在脊髓中的分布。进一步应用Western blot检测信号通路蛋白AMPK、p-AMPK、FOXO3、p-FOXO3的表达。结果:第一部分:与Sham组相比,SCI组大鼠术后运动功能显著低于正常水平。而与SCI组相比,利拉鲁肽干预的SD大鼠术后运动神经功能恢复能力较强。利拉鲁肽治疗组的BBB评分结果于术后第14、21、28天明显升高,与SCI组相比差异显著(P<0.05)。HE染色结果显示,Sham组脊髓组织完整,无坏死表现,而SCI组脊髓组织有大面积坏死空洞形成。与SCI组相比,利拉鲁肽治疗组脊髓坏死空洞面积较局限(P<0.05)。Nissl染色结果表明,SCI组脊髓前角运动神经元数量明显低于Sham组。而相比于SCI组,利拉鲁肽治疗组脊髓前角运动神经元数量增多(P<0.05)。Western blot结果显示,与Sham组相比,SCI组LC3BⅡ、Beclin-1蛋白表达量升高,p62表达量下降。与SCI组相比,利拉鲁肽干预组LC3BⅡ、Beclin-1表达量进一步增强,同时p62表达降低(P<0.05)。免疫荧光结果表明LC3B、Beclin-1、p62蛋白主要表达于神经元中,且荧光强度与WB结果相符。第二部分:除再次明确利拉鲁肽干预后,能显著促进脊髓损伤后运动功能恢复;抑制脊髓组织坏死空洞形成;增加脊髓前角运动神经元数量;并且激活神经元自噬反应外。与单纯利拉鲁肽治疗组相比,联合应用利拉鲁肽及AMPK选择性抑制剂Compound C后,SD大鼠脊髓损伤后运动功能BBB评分显著降低(P<0.05)。相较于单纯利拉鲁肽治疗组,HE染色显示出利拉鲁肽+Compound C组的脊髓组织坏死面积扩大(P<0.05);Nissl染色结果表明利拉鲁肽+Compound C组脊髓前角运动神经元数量显著降低(P<0.05)。与利拉鲁肽组相比,利拉鲁肽+Compound C组LC3BⅡ、Beclin-1表达量下降,p62表达增多(P<0.05);免疫荧光双染结果与WB结果相符。与SCI组相比,利拉鲁肽干预下p-AMPK/AMPK、FOXO3、p-FOXO3蛋白表达量升高(P<0.05);而应用Compound C后则抑制p-AMPK/AMPK、FOXO3、pFOXO3的表达量(P<0.05)。结论:第一部分:利拉鲁肽对于SD大鼠打击性脊髓损伤有潜在的治疗价值。利拉鲁肽干预能促进脊髓损伤后运动功能的恢复;保护受损的脊髓组织;促进创伤条件下脊髓前角运动神经元的存活;并激活神经元的自噬反应。第二部分:利拉鲁肽的神经保护作用通过AMPK-FOXO3信号通路调控自噬实现。AMPK选择性阻滞剂Compound C能显著逆转利拉鲁肽对脊髓损伤后神经功能恢复的促进作用;扩大脊髓坏死空洞面积;减少脊髓前角运动神经元存活数量;并且抑制自噬反应;以及抑制AMPK-FOXO3信号通路的蛋白表达。