论文部分内容阅读
背景:乳腺癌的发生发展是一个多基因参与,涉及复杂基因网络调控的过程。泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway,UPP)异常与乳腺癌的这一过程密切相关。越来越多的证据表明UPP途径通过调节蛋白降解在乳腺癌的肿瘤形成过程中发挥着重要作用。而作为泛素-蛋白酶体途径重要组成部分的泛素偶联酶2C(UBE2C)与乳腺癌的相关性越发受到关注。UBE2C的异常表达能通过使细胞提前终止有丝分裂、调节细胞生长相关蛋白等多种方式诱导乳腺癌进展,因此,靶向UBE2C有望成为治疗乳腺癌的新策略。然而,目前对于UBE2C基因对乳腺癌分子调控的相关机制尚未明确。目的:本研究以UBE2C基因为研究对象,通过采用小干扰RNA(si RNA)介导的UBE2C基因观察沉默UBE2C对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖、凋亡及迁移活性的影响,此外,通过同时沉默UBE2C及P53基因,探讨对以上生物学行为的分子机制,以期为UBE2C基因作为乳腺癌治疗的靶点提供进一步理论依据。材料和方法:化学合成针对UBE2C基因的si RNA-UBE2C序列及si RNA-P53序列。通过脂质体转染si RNA至MCF-7细胞,转染后24小时,采用Real-Time PCR及Western blotting分别检测UBE2C及P53 m RNA水平和蛋白质表达水平,将未进行任何处理的MCF-7细胞作为空白对照组,将转染阴性序列的MCF-7细胞作为阴性对照组。采用si RNA-UBE2C转染MCF-7细胞,以双转染(si RNA-UBE2C联合si RNA-P53)细胞及未转染细胞为对照,采用CCK8比色法对细胞的增殖进行检测;通过流式细胞仪对细胞的凋亡进行检测;通过划痕实验检测细胞的迁移情况。结果:1.Real-Time PCR检测结果显示:在进行转染后的24h,沉默UBE2C组UBE2C m RNA水平与空白对照组及阴性对照组相比呈显著下降,而相应的P53 m RNA水平较空白对照组和阴性对照组呈上升趋势。2.Western blotting检测结果显示:在进行转染后的24h,沉默UBE2C组UBE2C蛋白表达水平较空白对照组及阴性对照组显著降低,而P53蛋白水平表达较空白对照组和阴性对照组则呈上升趋势。3.Western blotting检测结果显示:在进行转染后24h,沉默P53组P53蛋白表达水平较空白对照组及阴性对照组下降;沉默P53组的UBE2C蛋白表达水平较空白对照组及阴性对照组变化不大。4.CCK8法检测结果显示:转染UBE2C基因后6h,12h,24h,沉默UBE2C组细胞增殖率明显高于空白对照组;双转染组(si-UBE2C+si-P53组)增殖率高于沉默UBE2C组,低于空白对照组。4.流式细胞术检测结果显示:转染UBE2C基因后,沉默UBE2C组细胞凋亡率较空白对照组明显升高;双转染组细胞凋亡率低于沉默UBE2C组,高于空白组。5.划痕实验结果显示:转染UBE2C基因后,沉默UBE2C组细胞迁移能力低于空白对照组;双转染组细胞迁移高于沉默UBE2C组,低于空白对照组。结论:1.沉默UBE2C基因可以促进乳腺癌细胞MCF-7的P53基因的表达,而沉默P53基因对乳腺癌细胞MCF-7的UBE2C基因表达影响不大,提示UBE2C基因可能通过某种信号通路或某种基因直接或间接地调控P53基因的转录和翻译。2.沉默UBE2C基因能够导致乳腺癌MCF-7细胞系凋亡的增加,增殖及迁移能力降低,提示UBE2C基因在MCF-7细胞系的凋亡、增殖及迁移方面能够通过某种机制发挥调控作用。3.沉默UBE2C基因能够通过上调P53基因的表达对乳腺癌MCF-7细胞系的增殖、凋亡及迁移能力进行调控。