【摘 要】
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长久以来,流感病毒每年可在全世界造成季节性流行和周期性的大流行,而A型流感病毒（Infleunza Avirus,IAV）是目前流行范围最广,致病力最强的一类流感病毒。血凝素蛋白（HA）是A型流感病毒中和抗体的主要靶点,如何诱导机体产生广谱性抗体一直是疫苗设计的重要目标。在流感病毒感染过程中,HA可被宿主细胞产生的蛋白酶裂解为HA1和HA2亚基,但HA2与HA1相比,其氨基酸序列更为保守,所以基于
【基金项目】
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国家自然科学基金（31772775）； 国家重点研发计划（2016YFD0500206）； 中央高校基本科研业务费（KYZ201726）；
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长久以来,流感病毒每年可在全世界造成季节性流行和周期性的大流行,而A型流感病毒（Infleunza Avirus,IAV）是目前流行范围最广,致病力最强的一类流感病毒。血凝素蛋白（HA）是A型流感病毒中和抗体的主要靶点,如何诱导机体产生广谱性抗体一直是疫苗设计的重要目标。在流感病毒感染过程中,HA可被宿主细胞产生的蛋白酶裂解为HA1和HA2亚基,但HA2与HA1相比,其氨基酸序列更为保守,所以基于HA2蛋白设计具有广谱性的单克隆抗体在A型流感病毒的预防和治疗中具有重要的应用价值。本研究以实验室前期制备的抗rPRB-A/chicken/Anhui/BRI99/2016（H9N2）毒株的单克隆抗体为研究对象,挑选出两株单克隆抗体,分别命名为6H9与3C12,针对这两株抗体,本文进行了深入研究。首先,采用蛋白免疫印迹试验（WB）和间接免疫荧光试验（IFA）对两株抗体与H1-H16亚型流感病毒及H17、H18亚型流感病毒HA基因真核表达蛋白的反应能力的广谱性进行鉴定,发现6H9和3C12均能与H1、H2、H5、H8、H9、H12、H13、H16亚型的病毒及H18亚型的HA蛋白发生反应。同样,6H9和3C12还能与所选取的、具有不同抗原特性的H1N1及H9N2亚型的其他流感病毒发生反应。由于两株抗体的反应特性一致,仅表现为与HA蛋白的亲和力差异,仅选取3C12进行了下一步的研究。通过对HA蛋白的截短实验及WB实验,鉴定出3C12识别的最短线性表位序列为433NAELLVL439,其位于HA蛋白结构的C螺旋区域。通过比对group 1和group 2 A型流感病毒HA2的基因序列发现,HA基因的第439位氨基酸的差异,导致了单抗3C12不能与group 2中的流感病毒发生反应。为了评价3C12的中和能力,进行了体内和体外中和能力评价。抗体的体外中和能力通过微量中和试验进行验证,选取与单抗有反应性的rPR8-A/duck/Alberta/35/76（H1N1）、rPR8-A/gull/Maryland/19/1977（H2N9）、rPR8-A/turkey/Wisconsin/1/1968（H5N9）、rPR8-A/turkey/Ontario/6118/1968（H8N4）、rPR8-A/chicken/Anhui/BRI99/2016（H9N2）、rPR8-A/duck/Alberta/60/1 976（H12N5）、rPR8-A/gull/Maryland/704/1977（H13N6）、rPR8-A/black-headed gull/Sweden/5/1999（H16N3）病毒以及两株 H9N2 亚型禽流感病毒 rPR8-A/chicken/Guangdong/1/2010、rPR8-A/chicken/Shandong/32/2015 进行实验,发现 3C12抗体对这些病毒均有中和能力,IC50值分别为52.1、34.7、52.1、52.1、17.4、34.7、34.7、17.4、34.7和34.7μg/ml。抗体的体内中和能力通过3C12对病毒感染小鼠的预防性和治疗性效果进行验证,选取rPR8-A/chicken/Anhui/BRI99/2016病毒对小鼠进行攻毒实验,攻毒剂量为10MLD50,抗体的预防性效果评价实验结果表明,当抗体的注射剂量为5mg/kg时,小鼠的存活率可达100%,且无任何的呼吸道症状;同样,抗体的治疗性效果评价实验结果发现,在病毒感染后的第一天和第二天注射15mg/kg的抗体时,小鼠的存活率均可达100%,如若在第三天注射抗体时,存活率可达60%。因此,本研究成功鉴定出一株对A型流感病毒具有广谱性反应性的单克隆抗体3C12,其识别表位位于HA蛋白的C螺旋区,该抗体是首个鉴定到的可识别该区域的单克隆抗体。通过一系列的研究证实该抗体在体外体内均有保护作用,对于A型流感病毒感染的预防和治疗具有重要的应用价值。此外,3C12识别的表位对于将来进行广谱性疫苗的设计提供了新的思路。
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