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背景甘露聚糖结合凝集素（Mannan-binding lectin,MBL）是天然免疫系统中的关键分子,能够通过其C端糖识别域（Carbohydrate-recognition domain,CRD）识别多种病原体表面的糖结构并激活补体系统。转化生长因子-β（Transforming growth factorβ,TGF-β）在T细胞的发育、增殖和分化过程中是关键性的调节因子,TGF-β介导的信号途径参与Th17、Treg细胞亚型分化。本课题组前期研究发现,在白假丝酵母菌（Candida albicans,C.albicans）感染时,MBL对Th17/Treg细胞免疫平衡的具有调节作用,但机制不清。本研究通过探究MBL对TGF-β介导的信号途径是否具有调节效应、以及对Th17/Treg细胞免疫平衡的改变是否具有相关性,从而揭示MBL对Th17/Treg细胞免疫平衡的调节机制。该研究对阐明MBL调节C.albicans诱导的免疫应答作用及机制方面,具有重要意义。目的研究在C.albicans感染时MBL是否通过调节TGF-β介导的信号途径进而影响Th17/Treg细胞免疫失衡及其后续炎症效应。方法1.体外实验分析TGF-β/Smad信号通路在MBL调控Th17、Treg细胞比例中的作用:采用免疫磁珠从WT小鼠脾脏中分选出CD4+T细胞,分别诱导其向Th17、Treg细胞分化的过程中,加入MBL蛋白和通路抑制剂干预,流式检测不同组别T细胞亚群的比例,Western blot检测RORγt、Foxp3及TGF-β/Smad通路中关键蛋白的表达变化。2.采用MBL基因敲除鼠建立白假丝酵母菌感染模型:分别对WT小鼠和MBL-/-小鼠进行腹腔注射5×107CFUs白假丝酵母菌,建立白假丝酵母菌感染模型;对照组WT小鼠和MBL-/-小鼠同时注射等量生理盐水。3.Western blot法检测四组小鼠目的蛋白表达:取各组小鼠磁珠分选出的CD4+T细胞,提取总蛋白,检测RORγt、Foxp3及TGF-β/Smad信号通路中关键蛋白的表达水平。4.qRT-PCR法检测相关基因表达水平变化:取各组小鼠分选出的CD4+T细胞,提取总RNA,逆转录成cDNA,检测不同组别RORγt、Foxp3和TGF-β/Smad信号通路中关键分子的mRNA表达情况。5.ELISA法检测细胞因子含量:收集各组小鼠静脉抗凝血,离心后取上清,ELISA法检测四组小鼠血浆中IL-17A、IL-21、IL-10和TGF-β的含量变化。6.流式细胞术检测:小鼠感染5天后进行摘除眼球取血,流式细胞术分析各组小鼠血液中Th17、Treg细胞的比例变化。7.病理检测:白假丝酵母菌感染5天后采集小鼠组织,采用H&E和PAS染色,评估各组真菌感染情况的差异;采用平皿稀释法检测各组小鼠组织载菌量变化。8.生存率分析:同时对WT小鼠和MBL-/-小鼠进行腹腔注射1×108CFUs白假丝酵母菌,对两组小鼠的存活情况进行为期14天的观察,记录小鼠的生存时间,用GraphPadPrism软件绘制生存曲线。结果1.体外实验结果显示,诱导CD4+T细胞分化为Th17细胞,MBL蛋白可使Th17细胞比例降低,且RORγt蛋白和p-Smad2（S465/467）表达水平减弱,加入TGF-β/Smad信号途径抑制剂处理后,MBL的抑制效应减弱,具有统计学意义。诱导CD4+T细胞分化为Treg细胞,MBL蛋白使Treg细胞比例上调,且Foxp3蛋白和p-Smad3（S423/425）表达水平增强,加入TGF-β/Smad信号途径抑制剂处理后,MBL的增强效应减弱,具有统计学意义。2.采用MBL基因敲除鼠成功建立了C.albicans感染鼠模型。3.Western blot和qRT-PCR结果显示,与WT感染小鼠相比,MBL-/-感染组小鼠Smad7、p-Smad2（S465/467）及其下游转录因子RORγt在蛋白和mRNA水平表达均增强;p-Smad3（S423/425）及其下游转录因子Foxp3表达均减弱。4.ELISA结果显示,与WT感染小鼠相比,MBL-/-感染组小鼠血浆中IL-17A、IL-21含量明显增高,IL-10、TGF-β的含量明显降低。5.流式细胞术结果显示,与WT感染组相比,MBL-/-感染组小鼠外周血中Th17细胞的比例明显升高,Treg细胞的比例明显下降。6.病理学分析结果显示,与WT感染小鼠相比,MBL-/-感染小鼠组织CFU值明显增高,组织病理学真菌感染情况更严重。7.与WT感染小鼠相比,MBL-/-感染C.albicans小鼠死亡率升高。结论MBL通过调节C.albicans感染小鼠体内TGF-β/Smad信号通路中关键信号分子Smad2、Smad3及Smad7的表达水平,抑制CD4+T细胞向Th17细胞亚型的诱导分化,促进CD4+T细胞向Treg细胞亚型的诱导分化,进而调控Th17/Treg细胞免疫平衡,抑制C.albicans诱导的炎症反应并减低其导致的感染致死率。