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支气管哮喘(bronchial asthma)是气道的慢性变应性炎症,气道内和气道壁浸润的炎症细胞如嗜酸性粒细胞、肥大细胞等释放出多种细胞毒性蛋白和炎症细胞因子,导致气道上皮损伤而激活修复反应,这种损伤与修复的反复交替最终导致了气道重塑。气道重塑是哮喘的特征性病理改变之一,是气道阻塞症状由可逆性发展成为不可逆性的基础,也是气道高反应性持续存在的基础。气道重塑的发生机制较为复杂,至今仍未完全清楚。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种广泛分布于人体组织细胞膜上的受体酪氨酸激酶。其配体包括表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、肝素结合性表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor, HB-EGF)、转化生长因子-α(transforming growth factor alpha, TGF-α)及双调蛋白(amphiregulin, AR)等,其中HB-EGF是多种细胞的促有丝分裂原,如气道上皮细胞和平滑肌细胞、肌纤维母细胞、血管平滑肌细胞等,可促进这些细胞的分裂、增殖和迁移；TGF-α可使黏蛋白在核酸和蛋白水平明显增高,杯状细胞超常增生,导致气道黏液过度分泌和黏液栓的形成,是引起哮喘气道梗阻和窒息的主要原因之一,提高了哮喘的发病率和死亡率。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(AG1478)对EGFR具有高度选择性,通过阻断EGFR介导的信号转导通路,使多种效应细胞(如气道上皮细胞、气道平滑肌细胞及血管平滑肌细胞等)的增殖受到抑制,并诱发细胞凋亡。目的本实验通过建立哮喘小鼠模型,探讨EGFR、HB-EGF、TGF-α在哮喘发病机制中的作用以及应用AG1478观察其对哮喘气道重塑的干预作用以及EGFR、HB-EGF、TGF-α表达的影响,为临床治疗提供理论依据。材料与方法1对象和模型制备方法健康清洁级BALB/c小鼠32只,雄性,6-8周龄,体重(15±2)g,按随机数字法分为四组：对照组、哮喘组、AG1478组、地塞米松组,每组8只。制备方法：哮喘组、AG1478组、地塞米松组小鼠分别在第1天、第8天、第15天腹腔内注射抗原混合液0.2 ml(含氢氧化铝lmg和卵蛋白20μg)致敏,第22天开始雾化吸入1%卵蛋白激发,隔日一次,每次30min,持续至第35天,共计7次。AG1478组和地塞米松组每次激发前1h分别给予腹腔内注射AG1478(15mg/kg)和地塞米松(10mg/kg)。对照组小鼠的腹腔内注射和雾化吸入均用生理盐水代替,次数同前。2标本采集各组小鼠于末次雾化结束后24h内用戊巴比妥钠45mg/kg腹腔内注射进行麻醉,迅速开胸结扎左肺门,取下左肺,置于液氮冻存,留作RT-PCR用；右肺生理盐水冲洗后取中叶,置于10%多聚甲醛溶液固定24h,石蜡包埋,选取垂直、平行气道取材,做厚度5μm切片,分别做Masson染色、PAS染色和免疫组织化学染色。3 EGFR、HB-EGF、TGF-α表达水平的测定3.1免疫组化、Masson染色和PAS染色切片应用计算机图像分析系统,在高倍镜(×400)下每张切片随机选取5个具有代表性的视野,分别选取阳性区域,免疫组化和Masson染色测量其密度值,PAS染色统计杯状细胞数量,计算平均值为最后的测定结果。3.2 RT-PCR应用凝胶分析软件Band Scan 5.0分别比较EGFR、HB-EGF与β-actin的相对A值并进行半定量分析。4统计学分析采用SPSS16.0统计软件包进行统计学处理,结果以均数±标准差(x±s)表示,各组样本均数经过方差齐性检验后,采用单因素方差分析,组间两两比较用LSD-t检验；两变量的相关性采用Pearson相关分析。以α=0.05为检验水准,P＜0.05为差异具有统计学意义。结果1动物一般情况观察哮喘组经过卵蛋白反复激发后,出现易激惹、烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、两便失禁等症状。AG1478组和地塞米松组也出现了哮喘组相似症状,但程度明显较轻。对照组无明显异常反应。2病理形态学观察普通光镜下(x200)观察,哮喘组小鼠气道壁增厚,管腔狭窄,气道上皮受损、脱落,上皮下胶原沉积明显,杯状细胞数量增加,黏液分泌增多,气道周围有大量炎性细胞浸润。AG1478组和地塞米松组的改变与哮喘组相似,但程度明显较轻。对照组未见明显的病理形态学改变。3肺组织HB-EGF和TGF-a蛋白的表达在小鼠肺内HB-EGF主要表达于气管黏膜上皮细胞,TGF-a主要表达于气管黏膜上皮细胞、气道平滑肌细胞和血管平滑肌细胞。HB-EGF、TGF-α在哮喘组的表达(0.587±0.110和0.585±0.078)显著高于对照组(0.196±0.052和0.241±0.062),P<0.05；AG1478组表达量(0.330±0.080和0.345±0.072)和地塞米松组表达量(0.372±0.073和0.384±0.054),明显低于哮喘组,P<0.05。4肺组织中EGFR和HB-EGF mRNA的表达应用RT-PCR检测显示,哮喘组EGFR和HB-EGF mRNA表达量(0.720±0.120和0.616±0.108),明显高于对照组(0.229±0.076和0.191±0.067),P＜0.05；AG1478组表达量(0.418±0.093和0.340±0.096)和地塞米松组表达量(0.446±0.010和0.391±0.101),较哮喘组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。5平均胶原沉积面积和平均杯状细胞数哮喘组小鼠上皮下胶原沉积面积和杯状细胞数(6.822±0.954和17.062±1.328)显著高于对照组(2.806±0.466和9.388±0.938),P＜0.05；AG1478组(4.007±0.805和13.025±0.956)和地塞米松组(4.206±0.832和13.412±0.904),明显低于哮喘组,P<0.05。6相关性分析哮喘组EGFR与胶原沉积面积和杯状细胞数的相关系数r分别为0.699和0.522,P＜0.01,说明EGFR与两者呈正相关。结论1.EGFR及其配体HB-EGF和TGF-α可能参与支气管哮喘气道重塑过程。2.表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(AG1478)可能通过下调EGFR、HB-EGF、TGF-α的表达以及抑制依赖于EGFR下游的细胞信号转导级联反应来缓解哮喘气道重塑过程。