喜树碱（Camptothecin,CPT）及其衍生物能够很好地抑制肿瘤细胞的增殖,因此广泛应用于临床癌症疾病的治疗。但喜树碱在喜树中天然合成量低,无法满足市场需求。因此,深入研究喜树碱的生物合成调控模式尤为重要。喜树碱的生物合成受多种因素影响,转录因子作为其中尤为重要的一个因素,具有显著调控植物次生代谢产物合成的功能。AP2/ERF（APETALA2/ethylene-response factor）家族转录因子是植物最大转录因子家族之一,之前的研究主要集中于其调控植物的生长发育,近几年来逐渐向调控植物次生代谢产物合成方向过渡。此外,研究证明,植物激素-脱落酸（abscisic acid,ABA）是植物生化防御系统中一种重要的信号分子,不仅调控植物非生物胁迫应答,而且对生物胁迫也具有很强的调控作用。AP2/ERF家族中的转录因子ORA47（octadecanoid-responsive AP2/ERF-domain transcription factor 47）能够结合ABA信号途径负调控因子ABI2的启动子中的顺式作用元件,通过调控ABA的生物合成,从而调控植物的次生代谢过程。本文从拟南芥AP2/ERF家族转录因子ORA47出发,通过同源相似性分析,从喜树转录组数据库中成功找出并克隆了与ORA47同源性最高的两个转录因子CaERF-1、CaERF-2,随后建立了组成型启动子和诱导型启动子的过表达体系,通过农杆菌瞬时转化技术侵染至喜树叶片,检测喜树碱的积累及喜树碱合成途径中关键酶基因的表达情况。首先,成功实现了CaERF-1、CaERF-2在喜树叶片中组成型瞬时过表达,且过表达后喜树碱的积累量提高1倍;喜树碱合成途径关键酶基因CaCYC1与CaG8O的相对表达量显著提高。其中,CaERF-2过表达后,喜树碱合成上游途径酶基因CaG8O相对表达量提高了约14倍,CaCYC1表达量提高了约27倍,调控效果十分显著。推测CaERF-1、CaERF-2通过调控途径关键酶基因CaCYC1与CaG8O表达量进而促进喜树碱的合成。第二,成功实现了由诱导型启动子rd29A驱动CaERF-1、CaERF-2在喜树叶片中的瞬时表达。经低温诱导后,转录因子CaERF-1、CaERF-2基因表达量明显升高,其中CaERF-1表达量提升了约2倍,CaERF-2表达量提升了约6倍。并且CaERF-1诱导过表达后,喜树碱合成途径上游关键酶基因Ca7DLS表达量上调了约9倍,ABA的转运蛋白基因CaABAT表达量上调了约3倍;CaERF-2诱导过表达后,喜树碱合成途径上游关键酶基因CaG8O表达量提升了约52倍,CaABAT表达量亦提升了约50倍。由此我们推测,转录因子CaERF-1、CaERF-2可能通过参与植物激素ABA的信号途径,调控植物激素ABA的合成,从而间接调控喜树碱的合成。第三,进一步分析了ABA与CaERF-1、CaERF-2的联系。浓度为20 mg/m L的ABA溶液对野生型喜树叶片进行浸泡处理0～4 h后,发现几乎所有喜树碱生物合成途径相关生物酶基因的表达量在2 h内显著增高。与此同时,两个转录因子CaERF1、CaERF2的基因表达量也明显上调。表明ABA能在一定程度上激活某些与喜树碱合成相关转录因子的活性,调控喜树碱合成代谢途径关键酶的表达,从而促进喜树碱的合成。第四,通过生物信息学分析,确定转录因子CaERF1、CaERF2均隶属于转录因子AP2/ERF家族,均含有一个AP2保守结构域,有很好的亲水性。并且多级结构预测显示它们主要由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链组成,可能参与激素信号转导和胁迫响应应答。并且CaERF-1比CaERF-2具有更好的稳定性,表明在调控植物次生代谢途径中,CaERF-1可能发挥更加稳定的作用。我们对其结构和功能的预测,对接下来解析其参与信号转导的具体机制奠定了良好的基础。综上所述,本文成功克隆了喜树中AP2/ERF家族转录因子CaERF1与CaERF2,并证实CaERF1与CaERF2可能通过两种途径调控喜树碱的生物合成。一种是CaERF-1与CaERF-2过表达激活了ABA信号通路,与ABA合成途径关键酶的顺式作用元件结合,调控ABA的合成,从而间接调控喜树碱的合成;另一种是外源激素ABA的信号会直接激活转录因子的活性,通过调控喜树碱合成上游途径关键酶基因CaCYC1、CaG8O等的表达,最终促进喜树碱的生物合成。这两种调控模式使调控网络变得更加的多元化。为后续揭示具体的调控位点与调控模式奠定了良好的基础。