过表达MIF促进宫颈癌SiHa细胞发生上皮间质转化的研究

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宫颈癌是全球妇女第二大常见的恶性肿瘤,虽然在过去的30年发生率和死亡率都有所下降,但是近年有年轻化的趋势,严重威胁妇女的健康。目前已经明确持续感染高危型人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌发生的重要原因,然而并不是所有感染HPV的患者都发展为宫颈癌。因此人们认为除了HPV,还存在其他影响宫颈癌发生的因素。研究发现,巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在宫颈癌细胞中高表达,且通过基因敲除、异种移植等实验技术证实了MIF在宫颈癌发生发展中的作用。同时越来越多的研究表明上皮间质转化(EMT)与上皮细胞恶性肿瘤的发生、发展有关,EMT不仅参与了宫颈癌的侵袭,而且与肿瘤的恶性进展有关。此外,MIF过度表达可以使E-钙粘蛋白表达减少、波形蛋白表达增加,此外还可以增加Snail的表达,这些都与EMT的发生一致。本研究以宫颈癌SiHa细胞株为研究对象,通过分析过表达MIF的SiHa细胞中Snail、E-钙粘蛋白、波形蛋白的表达情况,以及细胞的增殖和迁移能力,来探讨过表达MIF对宫颈癌上皮间质转化的影响目的:探讨过表达MIF是否可以促进宫颈癌SiHa细胞发生上皮间质转化,进而促进其增殖和迁移。方法:1.采用脂质体法将重组质粒转染至SiHa细胞,转染48小时后用荧光显微镜观察转染效率,并用RT-PCR方法进行验证。2.用RT-PCR方法检测各组细胞(转染重组质粒pEGFP-N1-MIF实验组;转染空质粒pEGFP-N1的阴性对照组;未转染的空白对照组)中Snail、E-钙粘蛋白、波形蛋白mRNA的表达水平。3.用免疫细胞化学方法检测各组细胞中Snail、E-钙粘蛋白、波形蛋白的蛋白表达水平。4.用CCK-8法检测各组细胞的增殖能力。5.用Boyden小室检测各组细胞的迁移能力。6.采用SPSS17.0统计软件处理,数据以均数标准差表示,不同组别细胞中MIF、E-钙粘蛋白、Snail、波形蛋白的mRNA及蛋白的表达以及细胞迁移能力的变化采用单因素方差分析,不同时间、不同组别细胞增殖能力的变化采用析因设计方差分析。P<0.05表示差别有统计学意义。结果:1.转染6小时后,即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光,且随时间增加荧光强度逐渐增强,48小时时最强。48小时转染效率约为(621.9)%。2.RT-PCR检测结果显示,实验组细胞中MIF mRNA的表达水平高于各对照组(p<0.01)。3.RT-PCR方法测得实验组细胞中Snail、波形蛋白mRNA的表达水平高于各对照组(p<0.01),E-钙粘蛋白的mRNA表达水平低于各对照组(P<0.01)。4.免疫细胞化学方法测得实验组细胞中Snail、波形蛋白的蛋白表达水平高于各对照组(P<0.05),而E-钙粘蛋白的蛋白表达水平低于各对照组(P<0.05)。5.CCK-8法检测结果显示:实验组细胞与各对照组细胞相比,细胞增殖能力明显增强(P<0.05),且随转染时间延长,促增殖作用更加明显;但是阴性对照组与空白对照组相比,差别无统计学意义(P>0.05)。6.Boyden小室趋化实验结果显示:实验组与各对照组相比,细胞迁移能力明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.重组真核表达载体成功转染SiHa细胞。2.过表达MIF促进SiHa细胞中Snail、波形蛋白的表达,抑制E-钙粘蛋白的表达。3.过表达MIF促进SiHa细胞增殖和迁移。综上所述,过表达MIF促进了上皮细胞向间质细胞的转化,并增强了SiHa细胞增殖和迁移能力。本实验可能为研究宫颈癌发生、发展的分子机制提供线索,为早期基因诊断及治疗提供有效标志物。
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