背景与目的:EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)感染与淋巴瘤的发生关系密切,既往多利用体外实验研究EBV对淋巴细胞的转化作用,但无法全面客观地反映EBV在体内诱发淋巴瘤的实际状况。本研究在构建人淋巴细胞(hu-PBL)/SCID嵌合体小鼠并产生EBV相关淋巴瘤的基础上,拟进一步鉴定该模型中EBV诱发瘤的分子病理特性,构建诱发淋巴瘤与相应“正常人”淋巴细胞之间差异基因表达谱和差异mi RNAs表达谱,利用生物信息学分析EBV诱发淋巴瘤的差异表达基因和mi RNAs,绘制EBV诱发淋巴瘤的分子调控网络,试图深入揭示EBV诱发淋巴瘤的分子机制。方法:从6名健康成人新鲜血液样本中分离出淋巴细胞,分别移植于22只SCID小鼠腹腔,每名献血员的淋巴细胞分别接种3~4只SCID小鼠,以EBV感染人淋巴细胞,建立EBV诱发淋巴瘤模型。应用免疫组化法鉴定诱发瘤的分子病理特征;PCR检测诱发瘤的种属来源;应用Ig H基因重排检测诱发瘤的克隆性。采用Agilent人类全基因组表达谱芯片及Exiqon mi RNAs芯片分别检测正常人淋巴细胞与EBV诱发淋巴瘤的差异表达基因及差异表达mi RNAs。运用三种差异分子筛选软件(LIMMA,BRB-Random Variance Model,SAM)同时筛选再取交集的方法分析差异表达基因及差异表达的mi RNAs。采用real-time PCR方法验证芯片检测结果。通过细胞实验使用si RNA干扰EBV+淋巴瘤细胞系中候选关键基因PBK的表达,检测细胞的生长特性及体外克隆形成能力。在此基础上,整合基因芯片和mi RNAs芯片结果,绘制diffmi RNA-diffgene整合调控网络。通过计算其富集度,得到在整合调控网络中的关键差异表达基因及差异mi RNAs。运用双荧光素酶报告基因技术验证ebv-mi R-BART16与其预测靶基因的靶向关系。结果:1.EB病毒诱发淋巴瘤模型的建立及分子病理特性本实验在9只存活SCID小鼠体内检出诱发肿瘤,因来源于6名献血员移植的淋巴细胞,共计得到6例诱发瘤组织。诱发肿瘤位于小鼠胸腔纵隔或腹腔内,呈不规则结节状。显微镜下观察诱发瘤细胞的体积较大,呈浆母细胞样淋巴细胞、中心母细胞和免疫母细胞样形态,符合弥漫性大B细胞淋巴瘤的形态特征。免疫表型检测诱发瘤LCA阳性,B细胞标记CD20/CD79a阳性,T细胞标记CD3/CD45RO阴性,提示诱发肿瘤是B细胞性淋巴瘤。Alu-PCR检测诱发瘤显示有人特异性Alu序列扩增条带,证实诱发瘤属于人源性,而非鼠源性。EBER原位分子杂交可见瘤细胞核显示阳性,表明诱发瘤细胞内存在EB病毒感染。实时定量PCR检测诱发瘤组织中LMP1的表达升高。Ig H基因重排PCR检测,显示该6例诱发瘤均呈现单克隆的峰和单一电泳条带的扩增产物。2.EBV诱发淋巴瘤的基因表达谱及功能分析采用人类全基因组表达谱芯片检测SCID小鼠体内的EBV诱发淋巴瘤组织与相应的“正常人”淋巴细胞的转录表达谱,通过生物信息学分析,得到202个差异表达基因,其中44个基因在肿瘤组织中上调,158个基因下调。对基因芯片结果的GO分析和pathway分析显示,富集度最高的GOs包括信号转导和细胞生长;富集度最高的pathway为细胞周期、细胞增殖和肿瘤免疫逃避。将202个差异表达基因的gene Symbol统一映射至HIPPIE的蛋白质互作网络数据库中,构建PPI网络图,计算这些基因在该分子网络中的RS值(Rank Score排序打分),基于转录组学分析挑选出在分子网络中排名前10位的差异表达基因,分别是:TOP2A,UHRF1,HIST2H2BE,PHGDH,VCL,IGF1R,FOS,SNAI1,PBK和RNF144B。它们分别涉及细胞增殖分化、免疫调节和免疫逃避等信号通路。其中TOP2A,UHRF1,PHGDH,PBK基因在诱发淋巴瘤中表达上调;HIST2H2BE,VCL,IGF1R,FOS,SNAI1和RNF144B基因在诱发淋巴瘤中表达下调。采用si RNA技术干扰Daudi淋巴瘤细胞PBK基因表达,细胞的生长速度下降,软琼脂克隆形成能力减弱。采用mi RNA芯片检测EBV诱发淋巴瘤与相应的“正常人”淋巴细胞的mi RNA表达谱,共筛出29个差异明显的人类mi RNAs,其中25个下调,4个上调;筛出3个上调的EB病毒mi RNAs(ebv-mi R-BART16,ebv-mi R-BART8*,ebv-mi R-BART19-3p)。4.差异表达基因和差异表达mi RNAs数据的整合分析基于上述差异表达mi RNAs(29 human mi RNAs+3 EBV mi RNAs)与其靶基因的关系对,结合差异表达基因的相互作用PPI网络,本研究构建了EBV诱发淋巴瘤的diff mi RNAs-diff genes整合调控网络。通过计算其富集度,得到在整合调控网络中的关键mi RNAs为hsa-mi R-23a,hsa-mi R-26a,hsa-mi R-26b,hsa-mi R-32,hsa-mi R-130a和hsa-mi R-222;关键靶基因为AURKA,PBK,IL1B和EGF;其中PBK和AURKA在淋巴瘤组织基因芯片检测中上调,而IL1B和EGF表达下调。差异表达的EB病毒mi RNAs与宿主细胞基因的靶向性分析显示,在基因芯片的差异基因中发现有能被ebv-mi RNA直接靶向调控的凋亡相关基因如RYBP和caspase-6。RYBP又名凋亡相关蛋白,可通过与caspase-8,-10等死亡受体凋亡途径的核心分子相互作用而促进细胞凋亡。caspase-6为caspase家族成员,是细胞凋亡的执行分子之一。本研究采用荧光素酶报告基因系统验证了ebv-mi R-BART16对RYBP和caspase-6的靶向作用,结果证实RYBP和caspase-6是3.EBV诱发淋巴瘤的差异mi RNA表达谱分析ebv-mi R-BART16的靶基因,其表达受到ebv-mi R-BART16的明显抑制。结论:1.通过构建hu-PBL/SCID嵌合体小鼠,成功建立EBV相关的人源性淋巴瘤动物模型,证实EBV诱发淋巴瘤来源于人B淋巴细胞,呈单克隆性增殖,病理学诊断类似于弥漫性大B细胞淋巴瘤。2.构建了EBV诱发淋巴瘤与其相应“正常人”淋巴细胞差异基因表达谱,筛选出202个差异表达基因,包括44个上调基因和158个下调基因,主要参与细胞增殖分化,免疫调节和免疫逃避等功能;表明EBV诱发淋巴瘤是一个涉及多个基因、多条通路,且病毒基因与宿主细胞基因相互作用的复杂过程。初步发现TOP2A,UHRF1,HIST2H2BE,PHGDH,VCL,IGF1R,FOS,SNAI1,PBK和RNF144B等可能是诱发淋巴瘤的候选关键基因。3.获得EBV诱发淋巴瘤的差异mi RNAs表达谱,筛选出29个差异明显的人类mi RNAs和3个上调的EB病毒mi RNAs。4.得到EBV诱发淋巴瘤的差异基因调控模块,构建了m RNAs-mi RNAs整合调控网络。结果提示EBV可能通过复杂的分子调控网络影响细胞周期调控、介导免疫逃避、促进细胞增殖和抑制凋亡信号等机制诱导淋巴瘤发生。5.ebv-mi R-BART16可靶向抑制宿主细胞RYBP和caspase-6的表达,可能具有抑制细胞凋亡的功能。