目的:巨噬细胞极化与感染、肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关,现有研究显示巨噬细胞极化有望成为疾病治疗的重要干预靶点。中草药猫爪草具有抗瘤、抗结核及抗炎等功效,用于辅助治疗结核、肺癌、恶性淋巴瘤等疾病。研究发现,猫爪草可增强巨噬细胞吞噬功能,但其对巨噬细胞极化的影响作用尚未见明确报道。本课题拟用猫爪草醇类提取物刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞,了解猫爪草对巨噬细胞极化的影响作用,探讨猫爪草醇类提取物中可影响巨噬细胞极化的主要成分,并初步研究其相关作用机制。为进一步开发猫爪草相关临床用药奠定研究基础,也可为后续深入探讨结核、肿瘤等疾病的中医治疗提供科学依据。方法:1.猫爪草醇提取物对小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞极化的影响设置六组浓度梯度的RTR分别诱导小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞,采用CCK8技术检测RTR对巨噬细胞活性影响,寻找RTR作用巨噬细胞的最佳浓度;以此浓度诱导M0型巨噬细胞,孵育0 h、12 h、24 h、36 h、48h、72 h,观察巨噬细胞的形态改变;Real-time PCR技术检测Arg-1、IL-10、TGF-β、i NOS、IL-6和TNF-α等细胞因子m RNA表达水平,ELISA技术检测不同时间点上清培养液中细胞因子(TNF-α、IL-10、TGF-β1)分泌水平变化,流式细胞术(FCM)检测F4/80、CD206、NOS2分子表达水平。2.猫爪草醇类提取物中影响巨噬细胞极化的主要成分筛选高效液相等技术分离并鉴定RTR全成分,筛选出可能诱导巨噬细胞M1极化的单体成分。取其最适浓度分别诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞24h,Real-time PCR技术检测M1/M2型相关巨噬细胞细胞因子m RNA相对表达水平,筛选出与RTR刺激小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞向M1型极化可能的单体化合物为棕榈酸(Palmitic Acid,PA),小毛茛内酯(Ternatlide,Tern)。3.PA/Tern对小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞极化的影响采用CCK8技术检测PA/Tern的巨噬细胞毒性,寻找其作用巨噬细胞的最佳浓度;以此浓度孵育24h,观察巨噬细胞的形态改变;Real-time PCR检测M1相关因子(i NOS、IL-6和TNF-α等)及M2相关细胞因子(Arg-1、IL-10、TGF-β等)m RNA表达水平,ELISA检测不同时间点细胞培养液上清TNF-α、IL-10、TGF-β1细胞因子分泌水平变化,FCM检测F4/80、CD206、NOS2分子表达水平。4.PA/Tern分别在猫爪草诱导M0巨噬细胞极化过程中的作用根据PA/Tern在猫爪草中的成分比例,分别以工作浓度诱导小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞0-72h,Real-time PCR检测M1/M2巨噬细胞相关细胞因子m RNA表达水平,ELISA检测不同时间点细胞培养液上清TNF-α、IL-10、TGF-β1细胞因子分泌水平变化,流式细胞术检测F4/80、CD206、NOS2分子表达水平。5.PA与Tern在猫爪草诱导M0巨噬细胞极化过程中的相互作用以PA/Tern工作浓度共同作用于小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞,孵育0-72h,Real-time PCR检测M1相关细胞因子(i NOS、IL-6和TNF-α等)及M2相关细胞因子(Arg-1、IL-10、TGF-β)m RNA表达水平,ELISA检测不同时间点细胞培养液上清TNF-α、IL-10、TGF-β1细胞因子分泌水平变化,流式细胞术检测F4/80、CD206、NOS2分子表达水平。6.RTR诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的可能机制培养成熟的M0型巨噬细胞经RTR、PA、Tern分别刺激24 h、48 h后,Western blot技术检测M1/M2相关MAPK信号通路及NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平。结果:1.RTR刺激小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞24h后,CCK8检测发现RTR诱导巨噬细胞最佳浓度为100μg/m L;巨噬细胞镜下观:与圆形(或椭圆形)的M0型巨噬细胞向比,诱导后的巨噬细胞两端细长中部宽大,且部分细胞出现伪足,与M1型巨噬细胞形态较为一致;Real-time PCR结果显示:RTR刺激小鼠骨髓来源M0巨噬细胞从12h i NOS、IL-6和TNF-α高表达,持续性低表达Arg-1、IL-10和TGF-β;ELISA结果显示:RTR刺激12 h后TNF-α、i NOS分泌水平开始升高,TGF-β分泌水平降低;FCM结果显示:RTR刺激36h后巨噬细胞NOS2表面膜分子的表达水平开始升高,CD206的表达水平降低;提示:RTR可诱导小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞向M1型极化。2.高效液相等技术结果显示,RTR全草中含量高于0.01%的单体化合物达50余种;结合文献报道,筛选出与炎症相关化合物:棕榈酸(PA)、小毛茛内酯(Tern)、豆甾醇、2-脱氧-D-核糖酸-1,4-内酯;Real-time PCR结果显示:PA、Tern诱导后M1型相关细胞因子m RNA的相对表达水平较高,均呈现上调表达;提示:PA和Tern可能参与RTR诱导巨噬细胞极化过程。3.不同浓度的PA、Tern分别诱导小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞24h,CCK8结果显示:PA浓度不高于400μmol/L时对巨噬细胞活性无影响,Tern浓度不高于150mmol/L时对巨噬细胞活性无影响;形态学显示:400μmol/L PA、150mg/L Tern诱导后巨噬细胞呈长梭形;分别以400μmol/L PA、150mg/L Tern诱导M0巨噬细胞0-72h进行后续实验。Real-time PCR检测结果显示:M1型相关细胞因子m RNA的相对表达水平呈高表达状态。ELISA结果显示:PA诱导后,TNF-α、i NOS分泌水平较对照组升高,TGF-β分泌水平较对照组降低;FCM结果显示:PA诱导组,巨噬细胞NOS2表面膜分子的表达水平升高,Tern诱导组,巨噬细胞CD86表面膜分子高表达,CD206的表达水平降低;提示:PA/Tern可诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞M1型极化。4.根据PA/Tern成分比例,分别以9.5μmol/L PA和75mmol/L的Tern分别诱导小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞0-72h,结果显示:75mmol/L的Tern诱导组Realtime PCR发现:抑炎性细胞因子(Arg-1、IL-10、TGF-β)呈现低表达状态;促炎性细胞因子(i NOS、白介素-6和肿瘤坏死因子-α)表达较对照组明显升高,FCM显示:CD86呈高表达状态;CD206持续性低表达;而PA诱导组无明显变化;提示:RTR诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞M1型极化过程中,Tern起主导作用。5.以9.5μmol/L PA和75mmol/L Tern共同作用于小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞0-72h,Real-time PCR检测i NOS、IL-6和TNF-α高表达;Arg-1、IL-10、TGF-β低表达;FCM检测结果显示:NOS2高表达;CD206低表达;提示:RTR诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞M1型极化,可能是PA与Tern共同作用的结果。6.Western blot检测信号通路相关蛋白的表达水平,RTR、PA、Tern分别诱导M0型小鼠骨髓来源巨噬细胞24 h、48 h后,NF-κB、p-p38-MAPK的表达明显上调。且较PA、Tern诱导后的表达水平高表达;提示:RTR诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞M1型极化可能与MAPK、NF-κB信号通路相关。结论:1.猫爪草醇提取物可促进小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞向M1型极化。2.猫爪草醇类提取物中诱导巨噬细胞M1型极化的主要成分是棕榈酸和小毛茛内酯,且两者发挥协同促进作用。3.猫爪草醇类提取物、棕榈酸、小毛茛内酯诱导巨噬细胞M1型极化可能与NF-κB/p38-MAPK信号通路相关。