背景慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染为免疫介导性疾病,宿主的天然免疫和获得性免疫功能对HBV清除和疾病转归有着重要影响,其中乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)血清学转换为慢性HBV感染者自然史或抗病毒治疗过程中的重要节点。研究表明慢性乙型肝炎(CHB)患者经抗病毒治疗后出现HBeAg血清学转换,可减少改善肝脏疾病进展,延缓和阻止肝硬化和肝细胞癌(HCC)发生,在临床实践中作为持久疗效和停药的指标之一。肝脏作为天然免疫优势器官,研究发现肝组织中包含有大量的各种天然免疫细胞,其中以自然杀伤(NK)细胞最为重要。NK细胞可通过分泌细胞因子如干扰素-γ (IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)介导抗病毒效应,同时其也是启动和调节适应性免疫应答的核心细胞之一。既往研究表明获得性免疫激活,特别是特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答对控制HBV感染具有重要作用,其主要通过分泌IFN-y和TNF-a以非溶细胞性机制降解病毒RNA、核壳体以及病毒DNA复制的中间产物,控制病毒的复制。宿主体内针对HBV的免疫应答不仅影响感染后自然结局,也影响着CHB患者抗病毒治疗的疗效,尤其和HBeAg血清学转换密切相关。效应细胞发挥作用离不开辅助性细胞的参与。CD4+T细胞在辅助B细胞产生抗体和维持有效的CTL应答方面起着非常重要的作用。如上所述,HBeAg血清学转换是机体特异性免疫应答的过程,由于HBeAg为T细胞依赖性抗原,B细胞产生HBeAb必须有辅助性CD4+T细胞的参与。虽然既往研究提示幼稚CD8+T细胞在协同信号刺激下增殖分化成为效应性细胞的过程并不依赖于CD4+T细胞辅助,但是,当机体再次接触病原体感染时,长寿命的功能性记忆性CD8+T细胞的产生、维持以及再次免疫应答反应有赖于辅助性CD4+T细胞参与。CD4+T辅助性细胞调节体液和细胞免疫应答主要通过分泌细胞因子发挥作用,值得注意的是在HBeAg血清学转换过程中可观察到许多重要细胞因子的变化。在α干扰素治疗的HBeAg阳性CHB患者中可观察到大量增加的具有生物活性的白细胞介素-12(IL-12)和辅助性T细胞(Th)1类细胞因子,重要的是,IL-12高峰出现的时间正好在HBeAg血清学转换之前或与之同步。在慢性HBV感染自然史的研究中也发现高水平血清IL-12与早期自发的HBeAg血清学转换有关。可见,细胞因子除了在启动和塑造HBV相关的免疫反应方面发挥决定性作用外,也与HBeAg血清学转换这一重要事件相关。根据CD4+T细胞所分泌的细胞因子和功能可以分为Th1、Th2、Th9、Th17、Th22和Treg等不同亚群,其中,Thl细胞亚群主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-a等介导细胞免疫应答。既往研究认为,辅助B细胞产生抗体的主要是Th2细胞亚群,其分泌的IL-4、IL-6和IL-10等细胞因子能促进B细胞增殖以及分化为浆细胞。近年来,学者们发现一种特殊的Th细胞位于淋巴滤泡,称之为滤泡辅助性T (Tfh)细胞,能够直接在生发中心辅助B细胞参与体液免疫。IL-21是Tfh细胞分泌的主要细胞因子,对促进B细胞分化为浆细胞的能力比Th2类细胞因子如IL-4和IL-10更强,被称之为B细胞生长因子。另外,近期研究显示IL-21作为媒介参与CD4+T细胞对CD8+T细胞免疫应答的辅助作用。可见,在慢性病毒感染中,CD4+T细胞分泌的细胞因子IL-21对促进B细胞功能和维持CTL应答具有重要作用。IL-21与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15同属于I型细胞因子家族成员,其主要由多种活化的CD4+T细胞分泌,包括Th17、NKT和Tfh等细胞亚群。IL-21受体(IL-21R)广泛表达于T细胞、B细胞、CD8+T细胞和NK细胞等,特别是高表达于B细胞。我们前期研究结果发现非活动性HBsAg携带者(发生]HBeAg血清学转换,病毒呈低复制水平)的血清IL-21水平和外周血中分泌IL-21的CD4+T细胞频数均显著增高。结合既往IL-21在其他慢性病毒,如人类免疫缺陷病毒(HIV)和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染中的作用研究,我们推测,在慢性HBV感染中IL-21可作用于体内多种细胞亚群,通过调节机体天然免疫和获得性免疫应答在HBV特异性抗体产生和病毒清除方面发挥重要作用。目的本研究以HBV感染自然史的横向人群和接受抗病毒治疗的CHB患者纵向队列为对象,分析IL-21在HBV感染中的特点,通过研究IL-21在HBV感染中与Tfh细胞、B细胞、CD8+T细胞以及NK细胞之间的作用,并结合HBV表达质粒携带小鼠模型,探讨IL-21在病毒清除和HBV特异性抗体产生中的作用。方法横向研究对象共纳入130例慢性HBV感染患者,包括免疫耐受期患者(IT)20例,HBeAg阳性CHB患者75例,非活动性HBsAg携带者(IC)35例,55例健康志愿者作为对照组(HC)。纵向研究对象来源于替比夫定治疗临床研究队列,共纳入108例HBeAg阳性CHB患者,所有研究对象在治疗基线、12周、24周和52周收集血清和肝素抗凝血。根据抗病毒治疗52周后应答情况分为完全应答组(CR)和非完全应答组(NCR),CR组定义为达到HBeAg血清学转换伴随HBV DNA低于检测下限(<2.5 log10 copies/mL),NCR组定义为未获得HBeAg血清学转换或HBV DNA>2.5 log10 copies/mL。根据抗病毒治疗52周后HBV DNA水平分为病毒学应答组(VR, HBV DNA<2.5 log10 copies/mL)和非病毒学应答组(NVR, HBV DNA>2.5 log10 copies/mL)。1.IL-21在HBV感染中的特点1.1选取慢性HBV感染患者和HC,分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量PCR检测血清和外周血单个核细胞(PBMC) IL-21的水平,采用免疫组织化学染色检测CHB患者和HC肝组织IL-21表达水平；1.2采用胞内细胞因子染色(ICS)方法检测HBeAg阳性CHB患者Th1、Th2、Th17以及Tfh细胞亚群IL-21表达水平；1.3应用微量样本多重蛋白定量(CBA)和ELISA分别检测纵向队列患者各时间点血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TOF-α、IFN-γ、IL-17和IL-21水平,观察各指标抗病毒治疗过程中的动态变化并比较CR组和NCR组各指标在不同时间点的差异。2.IL-21参与CXCR5+CD4+T细胞对B细胞免疫调节作用的研究2.1采用流式细胞术分析慢性HBV感染患者和HC外周血CXCR5+CD4+T细胞频数；采用HBV重叠多肽刺激外周血 CXCR5+CD4+T细胞比较两组的IL-21分泌水平；2.2采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记慢性HBV感染患者PBMC后,应用不同浓度的重组HBcAg (rHBcAg)和rHBeAg刺激,检测CXCR5+CD4+T细胞的增殖情况；2.3采用流式细胞术检测慢性HBV感染患者(IT、IC和CHB)以及纵向治疗队列(CR和NCR组)各时间点外周血CXCR5+CD4+T细胞亚群频数,分析抗病毒治疗12周CR和NCR组CXCR5+CD4+T细胞亚群频数变化的特点；2.4采用佛波酯／伊诺霉素(PMA/ionomycin)刺激慢性HBV感染患者PBMC,ICS检测CXCR5+CD4+T和CXCR5-CD4+T细胞分泌细胞因子情况；应用PMA/ionomycin或HBV重叠多肽刺激CXCR5+CD4+T细胞,ICS检测横向人群和纵向队列中该细胞亚群IL-21分泌水平；2.5流式分选纵向队列CR和NCR患者的CXCR5+CD4+T和CXCR5CD4+T细胞,与同源CD19+B细胞共培养,采用ELISA检测共培养上清IL-21水平,在共培养体系中应用rIL-21R-Fc外源性阻断IL-21或者加入rIL-21,采用ELISPOT检测分泌HBeAb的B细胞频数；2.6体外应用细胞因子诱导初始CD4+T细胞向CXCR5+CD4+T细胞分化,流式细胞术分析比较慢性HBV感染者和HC,CR组和NCR组患者之间细胞分化能力的差异；2.7流式细胞术分析比较CHB患者外周血CXCR5+CD4+T和CXCR5-CD4+T细胞PD-1、ICOS和IL-21表达水平差异,以及慢性HBV感染后行脾切除术的肝硬化患者外周血CXCR5+CD4+T细胞和匹配的脾脏CXCR5+CD4+T细胞表型分子表达的差异,分析慢性HBV感染后行脾切除术的肝硬化患者外周血CXCR5+CD4+T与脾脏ICOS+PD1+CXCR5+CD4+T细胞频数的相关性。3.IL-21对CD8+T细胞免疫调节作用的研究3.1磁珠分选慢性HBV感染患者,HC以及替比夫定治疗CHB患者基线,12周和24周外周血CD8+T细胞,采用荧光定量PCR检测IL-21R表达水平；3.2不同浓度重组IL-21(rIL-21)体外刺激CHB患者PBMC,流式检测CD8+T细胞频数和其表型分子CD69、CD45RO和CCR7的表达以及颗粒酶B、穿孔素和IFN-γ的分泌水平；3.3不同浓度rIL-21和HBV重叠肽体外刺激HLA-A2阳性CHB患者PBMC,采用CFSE染色方法检测CD8+T细胞的增殖能力；采用MHC-I Streptamer多聚体染色检测HBV特异性CD8+T细胞的频数；流式检测HBV特异性CD8+T细胞CD69、CD45RO和CCR7的表达；ICS检测HBV特异性CD8+T细胞颗粒酶B、穿孔素和IFN-γ的分泌水平。4.IL-21对NK细胞免疫调节作用的研究4.1流式细胞术检测HC和CHB患者外周血NK细胞表型表达(CD16、 NKG2A、NKG2D、NKp46);应用rIL-12、rIL-15和rIL-18联合刺激,ICS检测IFN-γ分泌；外周血PBMC与已负载HBVcore18-27肽的T2细胞(HLA-A2阳性)和TCR-Like抗体共培养6小时(h),ICS检测IFN-γ以了解NK细胞的 ADCC效应；4.2磁珠分选CHB患者外周血NK细胞,应用rIL-21体外刺激24h、48h和72h,检测NK细胞表型；纯化NK细胞,rIL-21单用或者分别联合rIL-12、rIL-15和rIL-18或与三种细胞因子联合体外刺激,ICS检测NK细胞IFN-γ分泌；纯化NK细胞在rIL-21刺激3天后,与已负载HBVcore18-27肽的T2细胞和TCR-Like抗体共培养,ICS检测IFN-γ以了解IL-21是否可以促进NK细胞的ADCC效应；4.3纯化NK细胞以CFSE标记,加入rIL-21刺激避光培养7天,流式细胞术检测NK细胞增殖；4.4纯化NK细胞以rIL-21单独或分别联合IL-12、IL-15和IL-18刺激30分钟,采用Phosflow的方法流式细胞术检测信号传导蛋白和转录激活物3 (STAT3)和STAT4磷酸化水平。5.IL-21在HBV表达质粒携带小鼠模型中的研究5.1采用尾静脉高压注射pSM2质粒(10μg/只)至野生型C57BL/6小鼠和IL-21R基因敲除小鼠,以及pUC19质粒(10gg/只)至野生型C57BL/6小鼠建模,在注射后各时间点眼眶后取血留取血清检测HBsAg、HBsAb和IL-21。分离外周血和肝内淋巴细胞进行流式检测分析；留取肝组织进行HE染色、免疫组化分析和检测IL-21mRNA水平；5.2采用尾静脉注射rAAV8-1.3HBV至野生型C57BL/6小鼠体内,在注射后各时间点眼眶后采血,收集血清检测HBsAg。12周后根据HBsAg水平对小鼠进行配对分组,实验组予尾静脉注射小鼠IL-21-GFP-重组腺病毒,尾静脉注射空载GFP重组腺病毒或PBS作为对照,在注射第1、4、7、10和13天眼眶后取血留取血清检测IBsAg、HBsAb和IL-21。6.统计学处理计量资料以均数±标准差(mean±SD)或四分位间距表示。计数资料采用列联表卡方检验；两组间计量资料采用两独立样本t检验,不满足方差分析条件时采用两独立样本秩和检验Mann-Whitney U检验；配对样本不同处理的计量资料采用Wilcoxon符号秩检验。多组间计量资料采用单因素方差分析,不满足方差分析条件时采用多个独立样本非参数Kruskal-Wallis H检验,多个相关样本采用Friedman M检验,多重比较采用两独立样本秩和检验；纵向研究中样本重复测量数据比较采用一般线性模型重复测量分析,保守Greenhouse-Geisser法校正得到的交互效应的P值用于单变量分析,不同时间点组间多重比较采用LSD-t检验。所有数据采用SPSS 13.0和Graphpad Prism 5.0进行处理及构图,所有统计分析基于双侧假设检验,以α=0.05为检验水准,P<0.05具有统计学意义。结果1.IL-21在HBV感染中的特点1.1慢性HBV感染患者血清IL-21浓度和外周血PBMC IL-21mRNA表达水平均显著高于HC(P<0.001；P<0.001),免疫组化染色显示CHB患者肝内IL-21表达较HC明显增强；1.2 CHB患者IL-21主要来源于CD4+Th细胞,其中Th1、Th2、Th17以及Tfh细胞亚群均可分泌IL-21,以Thl和Tfh细胞亚群明显,两者表达水平均显著高于Th2和Th17细胞亚群；1.3动态观察48例接受替比夫定治疗52周的HBeAg阳性CHB患者各时间点细胞因子变化,结果显示血清TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17和IL-21水平随抗病毒治疗而下降,治疗52周时水平较基线相比均具有统计学差异(P<0.001; P=0.002; P<0.001; P<0.001; P<0.001; P=0.007),血清IFN-γ和IL-4水平在治疗前后变化无统计学差异；CR组患者(n=7)抗病毒治疗12周血清IL-21水平显著高于NCR组(n=41)(P=0.022)。2.IL-21参与CXCR5+CD4+T细胞对B细胞免疫调节作用的研究2.1采用PMA/ionomycin非特异刺激慢性HBV感染患者PBMC,结果显示CXCR5+CD4+T细胞主要分泌IL-21,其表达量明显高于其分泌的IL-4、IL-17和IFN-γ(P<0.001),而CXCR5-CD4+T细胞则以分泌IFN-y为主；2.2慢性HBV感染者外周血CXCR5+CD4+T细胞频数显著高于HC(P<0.001)。HBV重叠多肽刺激CXCR5+CD4+T细胞,虽然仅有小部分细胞能分泌IL-21,但是慢性HBV感染者HBV特异性IL-21分泌水平显著高于HC组(P<0.001)。采用不同浓度的rHBcAg和rHBeAg刺激CFSE标记的PBMC检测CXCR5+CD4+T细胞的增殖能力,结果显示rHBcAg和rHBeAg刺激CXCR5+CD4+T细胞增殖呈剂量依赖性,高浓度rHBcAg可促进CXCR5+CD4+T细胞增殖,但过高浓度rHBeAg则抑制该细胞亚群增殖；2.3横向研究显示能够发生自发HBeAg血清学转换的IC组,其外周血CXCR5+CD4+T细胞亚群的频数显著高于未发生HBeAg血清学转换的IT组(P<0.001)和CHB组(P<0.001)患者。纵向研究结果显示,能够发生HBeAg血清学转换的CR组(n=16)患者,其CXCR5+CD4+T细胞亚群的频数在12周、24周和52周这三个时间点均显著高于NCR组(n=26)患者(P<0.05),重复测量结果显示CR组患者总体CXCR5+CD4+T细胞亚群频数显著高于NCR组患者(P=0.009)。CR组中87.5%患者(14/16)在抗病毒治疗12周后其CXCR5+CD4+T细胞频数呈升高趋势,而NCR组中只有50%的患者(13/26)呈现上升趋势,显著低于CR组(P=0.014)；相关分析发现12周CXCR5+CD4+T细胞频数和基线之间的差值与血清HBeAg在12周和基线之间的差值成负相关(r=-0.358,P=0.020),即CXCR5+CD4+T细胞抗病毒治疗12周后频数增加幅度与HBeAg降低幅度正相关；2.4采用PMA/ionomycin刺激横向研究患者CXCR5+CD4+T细胞,结果发现IC组患者IL-21+CXCR5+CD4+T细胞频数显著高于CHB、IT和HC组(P<0.001)。HBV重叠多肽刺激发现IL-21+CXCR5+CD4+T细胞频数在IC组患者中最高(P<0.001)；纵向队列中的结果显示抗病毒治疗24周和52周时,CR组(n=12)患者HBV特异性IL-21+CXCR5+CD4+T细胞频数显著高于NCR组(n=15)(P=0.005；P=0.002)；2.5分选纵向队列患者CXCR5+CD4+T或CXCR5-CD4+T细胞与同源CD19+B细胞共培养,ELISPOT检测发现无论是CR组或NCR组,其CXCR5+CD4+T细胞均能促进B细胞产生HBV相关抗体。在发生HBeAg血清学转换的CR组(n=10)患者,其B细胞在CXCR5+CD4+T细胞辅助下分泌HBeAb水平显著高于NCR组(n=10)患者(P=0.011)。ELISA检测培养上清IL-21水平,结果显示无论是CR组或NCR组,CXCR5+CD4+T细胞与B细胞共培养上清的IL-21水平显著高于CXCR5"CD4+T细胞(P=0.007；P=0.013)。体外CXCR5+CD4+T细胞与B细胞共培养体系中加入 rIL-21R-Fc阻断IL-21后,结果发现分泌HBeAb的B细胞频数显著降低(P=0.027)。在CXCR5-CD4+T细胞与B细胞共培养体系中加入rIL-21后,分泌HBeAb的B细胞频数显著增加(P=0.043)；2.6慢性HBV感染者和HC初始CD4+T细胞在体外均能成功诱导为CXCR5+CD4+T细胞,CR组(n=6)患者和NCR (n=6)患者其初始CD4+T细胞分化为CXCR5+CD4+T细胞能力无统计学差异(P=0.59)；2.7 CHB患者外周血CXCR5+CD4+T细胞PD-1、ICOS和IL-21表达水平均明显高于CXCR5-CD4+T细胞(P<0.001)。慢性HBV感染后行脾切除术的肝硬化患者脾脏CXCR5+CD4+T细胞和其配对的外周血CXCR5+CD4+T细胞均高表达CD45RO,脾脏CXCR5+CD4+T细胞则高表达ICOS, PD-1和CD69(P=0.005),而外周血CXCR5+CD4+T细胞则高表达CCR7 (P=0.003)。慢性HBV感染后行脾切除术的肝硬化患者(n=10)外周血CXCR5+CD4+T细胞与脾脏ICOS+PD-1+CXCR5+CD4+T细胞的频数呈正相关(r=0.723,P=0.018)。3.IL-21对CD8+T细胞免疫调节作用的研究3.1慢性HBV感染者外周血CD8+T细胞IL-21R mRNA水平显著高于HC组(P<0.001)。病毒学应答组(VR) CHB患者12周CD8+T细胞IL-21R mRNA水平较基线显著降低(P=0.017), NVR组12周CD8+T细胞IL-21R mRNA水平呈增加趋势,与基线相比无统计学差异,但显著高于VR组患者(P=0.007)；3.2 rIL-21体外刺激可促进CHB患者CD8+T细胞CD69表达(P=0.035),颗粒酶B(P<0.001)和穿孔素的分泌(P=0.004)。在HBV重叠肽的作用下,rIL-21可增加HBV Core特异性CD8+T细胞频数(P--0.012)和HBV特异性颗粒酶B的分泌(P=0.047),但未能明显增强穿孔素和IFN-y表达。4.IL-21对NK细胞免疫调节作用的研究4.1 CHB患者外周血NK细胞抑制性受体NKG2A和激活性受体NKp46表达频数显著高于HC(P<0.001；P=0.001),而激活性受体CD16和NKG2D表达则显著降低(P=0.001；P=0.042)。与HC相比,CHB患者外周血NK细胞介导ADCC的能力和分泌IFN-γ水平显著降低(P<0.001；P=0.017)；4.2体外实验发现rIL-21可显著上调CHB患者NK细胞CD16、NKp46和NKG2D表达(P<0.001)。单用rIL-21刺激可提高NK细胞分泌IFN-γ,并促进rIL-12、rIL-15和rIL-18对NK细胞IFN-y分泌的作用。rIL-21可显著提高NK细胞ADCC效能和增殖能力(P=0.008；P=0.022)；5.IL-21在HBV表达质粒携带小鼠模型中的研究5.1高压尾静脉注射pSM2质粒的野生型C57BL/6小鼠外周血和肝内IL-21水平,CXCR5+CD4+T细胞以及CD19+B细胞的频数均较对照组小鼠显著升高(P<0.05)；5.2高压尾静脉注射pSM2质粒的IL-21R基因敲除小鼠在注射后第10天、13天和16天血清检测HBsAg仍为阳性,HBsAg水平均显著高于野生型小鼠(P=0.003；P=0.002；P=0.010)。所有IL-21R基因敲除小鼠均未检测到HBsAb;5.3尾静脉注射小鼠IL-21-GFP-重组腺病毒可促进rAAV8-1.3HBV病毒体内转导法建立的HBV持续表达小鼠的HBsAg清除和HBcAb产生。结论1.CHB患者血清和肝内IL-21水平均高于HC组,CHB患者替比夫定治疗12周血清IL-21水平能预测治疗52周HBeAg血清学转换,提示IL-21可作为CHB患者抗病毒疗效评价的免疫学指标；2. CXCR5+CD4+T细胞的频数在发生HBeAg血清学转换的慢性HBV感染者更高,其可通过分泌IL-21促进B细胞产生HBeAb,提示通过扩增CXCR5+CD4+T细胞或促进IL-21表达可能有助于CHB患者的优化治疗；3.rIL-21体外刺激可促进CHB患者CD8+T细胞活化,增强HBV特异性和非特异性CD8+T细胞的细胞毒活性,提示其在促进肝脏炎症和损伤中发挥作用：4.慢性HBV感染可导致NK细胞功能受损,rIL-21可促进慢性HBV感染患者NK细胞IFN-y分泌和ADCC功能,增强其抗病毒效应,提示IL-21靶向重塑NK细胞功能的免疫策略可能有助于控制慢性HBV感染；5.HBV表达质粒携带小鼠模型的体内研究表明IL-21在HBsAg清除和HBV特异性抗体产生中发挥重要作用。