糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy, DR)是视网膜长期暴露于高血糖状态下，血管内皮发生功能障碍而导致的微血管损伤引起的微血管病变。微血管损伤包括血管基底膜增厚、血管-视网膜屏障缺损和血管周细胞丧失，而高血糖的毒性作用是糖尿病视网膜病变最初发生的扳机点。早有文献报道，高血糖产生过多的活性氧分子(Reactive Oxygen Species, ROS)，使蛋白质糖化、细胞膜和细胞质内的不饱和脂肪酸氧化，这些氧化产物产生的细胞毒作用能损伤血管内皮细胞，并且是糖尿病微血管损伤的主要原因。同时，高血糖还可以使另一种活性氧分子NO在视网膜中产生增多，NO是氧分子和L-精氨酸在一氧化氮合酶的催化下产生的，一氧化氮合酶有三种同工酶，分别是主要存在于中枢和外周神经细胞中的神经型一氧化氮合酶(NOS Ⅰ或nNOS)、在炎症或损伤等刺激下可存在于多种细胞内的诱导型一氧化氮合酶(NOS Ⅱ或iNOS)以及主要存在于血管内皮细胞内的内皮型一氧化氮合酶(NOS Ⅲ或eNOS)。各种类型一氧化氮合酶产生的NO其生理或病理作用各不相同，链脲佐菌素所致糖尿病大鼠的视网膜及其高浓度葡萄糖培养的牛视网膜内皮细胞NO含量增高、iNOS表达增加，并且NO可使血管-视网膜屏障通透性增高，提示作为活性氧分子重要组成部分的NO也参与了糖尿病视网膜微血管损伤的病理过程。但是中长期糖尿病视网膜中的NO及其合酶在视网膜损伤中的作用目前还没有报道。 nNOS来源的NO可以调节血管紧张度、调节血流量可能有助于减轻血管的高灌注状态，提示nNOS来源的NO对视网膜血管损伤可能具有保护作用。南京医科人学博}_学位论文 作为气体的NO会很快弥散，因而直接测定组织内的NO十分困难。组织中的NO气体可以被超氧阴离子(o:)氧化变成有细胞毒作用的过氧化峭酸盐(ONOO口)，ONOO口修饰蛋白质中的酪氨残基生成峭基酪氨酸(NT)，应用免疫组化或ELI SA方法可以间接反应组织中NO含量和02一的含量，间接反应组织中氧化应激的损伤情况。 另一方面，视网膜的损伤会释放出大量细胞因子，如TGF一口:、VEGF、PDEF、bFGF等等。这些细胞因子促使新生血管生成，新生血管极易发生破裂、出血，是糖尿病视网膜病变视力丧失的重要原因。目前已知vEGF是新生血管形成的关键因素，但是其他细胞因子也起重要作用。有研究显示，TGF一日:在DR新血管形成过程中也起重要作用，但现有报道为数不多，并有结论相反的报道。同时，关于TGF-口:在DR新生血管形成过程中的作用机制，尚无研究报道。 为了进一步研究NO和NOS在糖尿病视网膜损伤中的作用，探询TGF一日:在新生血管形成过程中的作用和作用机制。我们设计并进行了以下实验。 1、链脉佐菌素制备大鼠糖尿病模型，注射生理盐水作为对照，分别取正常对照及模型制备成功后大鼠视网膜标本进行以下实验。 2、利用免疫组化及图象处理技术，分析硝基酪氨酸在视网膜中的分布及含量。 3、利用免疫组化及Rl，一PCR技术，测定iNOS及nNOS的蛋白及mRNA表达。 4、用Westem blot方法坝，{定TcF一口:的表达，RT-PCR测定其受体TGF一口Rl及TGF一口R 11的表达。 结果发现:l、链豚佐菌素(65mg/kg)腹腔注射一次，制备糖尿病大鼠模型，南京医科人学博卜学位论文链朦佐菌素腹腔注射后，大鼠直至实验结束，血糖均维持在(l 6.65mmol几)以上，证明造模成功。 糖尿病大鼠视网膜内的NT在糖尿病2、4、SW大鼠的表达升 高，但阳性细胞只分布于神经节细胞层，提示糖尿病大鼠的视网 膜损伤首先发生在神经节细胞层。糖尿病20W的大鼠NT表达量 明显增高，并且阳性细胞遍布视网膜全层，显示随糖尿病病程进 展视网膜氧化损伤进行性加重，NO产生增多。 和对照相比，糖尿病Zw大鼠的iNOS表达增加，nNOS表达 下降，糖尿病20W大鼠的iNOS进一步增加，而nNOS几乎消失， 提示糖尿病大鼠视网膜内NO产生增多和nNOS表达下降与iNOS 表达升高有关。 糖尿病大鼠视网膜内TGF一口:随糖尿病进展表达增加，其受体 TGF一口Rl的表达和对照组相比无显著变化，而TGF一日Rn的表 达显著性增加。提示TGF一日:在DR形成过程中有重要作用，并 有可能通TGF一口Rn型受体起作用。 为进一步阐明TGF一日:在糖尿病视网膜病变形成中的作用，我们又分别收集了临床上糖尿病不伴有眼底改变与糖尿病伴有视网膜病变患者的前房液标本，以及无糖尿病患者的前房液标本作为对照，用ELISA方法测定了TGF一吕:和VEGF的含量。 结果发现，和对照相比糖尿病患者眼前房液中VEGF的含量均显著增加，并且随着糖尿病视网膜病变的进展而增高;而糖尿病无眼底改变患者前房液中TGF一口:含量与正常相比无明显变化，单纯型糖尿病视网膜病变患者的TGF一口:含量下降，伴有增生型的视网膜病变患者TGF一日:含量升高。提示TGF一口:和vEGF在糖尿病视网膜新生血管的发病过程中起协同作用。南京医科人学博卜学位论文 视网膜损伤是糖尿病视网膜病变的基础和前提条件，早期发现、及时治疗是防止糖尿病视网膜病变产生、防止糖尿病视网膜病变病人视力丧失的有效?