论文部分内容阅读
睾丸酮丛毛单胞菌是以环境中的甾体激素作为其生存的唯一碳源和能源，并能够通过体内的一系列酶将甾体激素降解为水和二氧化碳，以此特性而成为研究热点。 短链脱氢酶（SDRs）是睾丸酮丛毛单胞菌中一类依赖于NAD(P)H的氧化还原酶，17β羟基类固醇脱氢酶是 SDR超级家族成员之一，其主要功能是催化类固醇的羟基/酮基的氧化还原。本文成功从睾丸酮丛毛单胞菌ATCC11996中克隆出17β羟基类固醇脱氢酶（17β-HSDX）基因，构建了重组表达载体pET-15b-17β-HSDX，将重组表达载体转化入大肠杆菌 BL21中，成功表达并通过Ni柱亲和层析的方法纯化了17β-HSDX蛋白，分子量约为27.2KDa，纯化后浓度为2.64mg/mL。17β-HSDX基因包含750bp碱基，编码249个氨基酸组成。利用纯化后的蛋白免疫兔子，制备了效价为1：16000的17β-HSDX多克隆抗体，并建立了测定17β-HSDX的标准曲线。分别用睾丸酮、雌酮、雌二醇、雌三醇来诱导睾丸酮丛毛单胞菌，用Elsia方法分别测定了17β-HSDX蛋白的表达量，发现在睾丸酮和雌酮进行诱导时17β-HSDX蛋白的表达量较高。利用同源重组的方法敲除17β-HSDX基因，成功获得17β- HSDX缺失的突变菌株。利用高效液相色谱法对突变型与野生型菌株的培养基中四种诱导激素的残留量进行检测，在睾丸酮和雌酮的诱导下，野生型和突变型的培养基中两种激素的残留量差值最为明显。因此17β-HSDX对降解睾丸酮和雌酮起到了重要作用。