已有研究显示,Cripto-1（CR-1）作为一种癌基因,在正常成人组织中低表达或不表达,但是在乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中异常高表达,并且在癌症的发生和发展过程起到重要作用。因此,Cripto-1是一种抗肿瘤药物筛选的潜在靶点。本实验室前期通过构建针对Cripto-1启动子和Cripto-1 m RNA 3’UTR化合物的筛选模型,对700余种中药单体化合物进行筛选,已经初步得到31种潜在的能够抑制Cripto-1蛋白表达的小分子化合物。基于前期的研究基础,本研究中,我们为找出能显著抑制Cripto-1表达的最佳化合物,选取多种Cripto-1高表达的肿瘤细胞系及其对应的正常细胞系,对前期获得的31种小分子化合物的抑制Cripto-1蛋白表达作用进行了进一步的筛选,结果发现,化合物TI150能够有效抑制Cripto-1蛋白在多种肿瘤细胞中的表达,本文继续以化合物TI150为研究对象,对其抗肿瘤作用和分子机制进行深入研究。1.目标化合物的筛选及其抗肿瘤活性的初步分析（1）目标化合物的筛选为了在已知31种化合物中筛选出抗肿瘤活性高且对正常细胞毒性较小的化合物,我们采用MTT法检测了上述31种化合物分别对5种内源性Cripto-1高表达的肿瘤细胞（胃癌细胞SGC7901、宫颈癌细胞He La、肝癌细胞Hep G2、SMMC7721和Bel7402）及其相应的正常细胞（人胃粘膜细胞GES-1、人宫颈上皮细胞H8和人肝正常细胞L02）活力的抑制作用。通过计算31种候选化合物对上述5种肿瘤细胞及相对应正常细胞的IC50值和IC10值,我们分析得出只有候选化合物TI150能够较好地的符合抗肿瘤活性高,同时对正常细胞毒性小的标准,化合物TI150对He La细胞和SGC7901细胞的抑制活性较高,且对相应正常细胞H8和GES-1的毒性较小。因此,我们选取化合物TI150作为研究对象,并对其抗肿瘤活性进行了深入研究。（2）目标化合物TI150对内源性Cripto-1表达的影响我们利用Western blot法,选取5种内源性高表达Cripto-1蛋白的肿瘤细胞（胃癌细胞SGC7901、宫颈癌细胞He La、肝癌细胞Hep G2、SMMC7721和Bel7402）,对化合物TI150作用后细胞内Cripto-1蛋白的表达量进行了检测。最终我们发现,化合物TI150能够明显抑制上述5种肿瘤细胞中Cripto-1蛋白的表达水平。（3）目标化合物TI150的体外抗肿瘤活性分析由于Cripto-1具有促进肿瘤发生发展的作用,所以我们进一步检测了化合物TI150的抗肿瘤活性。我们依旧选取上述5种内源性高表达Cripto-1蛋白的肿瘤细胞,同时选取内源性低表达Cripto-1蛋白的肺癌细胞A549和卵巢癌细胞SKOV3作为对照,利用MTT法检测化合物TI150对上述肿瘤细胞活力的影响。结果发现,化合物TI150能够明显抑制上述肿瘤细胞的活力,且随作用时间的增长,作用浓度的增加,抑制效果增强;对内源性高表达Cripto-1蛋白的肿瘤细胞作用效果好于内源性低表达Cripto-1蛋白的肿瘤细胞。以上结果说明,化合物TI150能够抑制多种肿瘤细胞的活力,且很有可能通过抑制Cripto-1蛋白的表达来发挥其抗肿瘤活性。2.目标化合物TI150的抗肿瘤作用的机制研究（1）目标化合物TI150对He La细胞和SGC7901细胞凋亡的影响为了阐明化合物TI150抑制肿瘤细胞的具体机制,我们首先检测了其对肿瘤细胞凋亡的影响。TUNEL法检测结果显示,化合物TI150作用后,He La细胞和SGC7901细胞均出现明显的细胞核断裂、染色质凝集等凋亡形态;Western blot结果显示,化合物TI150作用后,凋亡相关蛋白（Cleaved-Caspase-9、Cleaved-Caspase-3）的水平明显升高。以上结果说明,TI150可诱导He La细胞和SGC7901细胞发生细胞凋亡。（2）目标化合物TI150对He La细胞和SGC7901细胞增殖的影响我们随后检测了化合物TI150对He La细胞和SGC7901细胞增殖能力的影响。细胞克隆形成实验和Brd U掺入实验结果显示,化合物TI150作用后,He La细胞和SGC7901细胞克隆形成数量明显减少,Brd U掺入值显著降低。流式细胞术对细胞周期的检测结果显示,化合物TI150作用后,He La细胞和SGC7901细胞S期细胞比例显著增高;Western blot结果显示,SGC7901细胞中Cyclin E、CDK2蛋白表达下调,P21蛋白表达上调;He La细胞中Cyclin E、Cyclin A、CDK2蛋白表达下调,P21蛋白表达上调,这也与流式分析结果相一致,说明化合物TI150能够导致细胞发生S期阻滞。以上结果说明,化合物TI150可以抑制He La细胞和SGC7901细胞的增殖能力。（3）目标化合物TI150对He La细胞和SGC7901细胞糖代谢的影响我们随后想到化合物TI150在抑制He La细胞和SGC7901细胞的细胞活力时,是否对He La细胞和SGC7901细胞的糖代谢过程产生了影响。我们用Western blot法检测了化合物TI150对细胞内部分糖代谢相关蛋白表达的影响。Western blot结果显示,化合物TI150能够在一定程度上抑制SGC7901和He La细胞中糖代谢相关蛋白HK2、GLUT1、GLUT4的表达,提示化合物TI150在一定程度上抑制了细胞的有氧糖酵解过程,对He La细胞和SGC7901细胞糖代谢过程产生了一定的影响。3.目标化合物TI150的抗肿瘤活性与其抑制Cripto-1表达之间的相关性研究基于以上研究结果,我们确定了化合物TI150对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用,并且化合物TI150能够通过诱发肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖两个方面来发挥其抗肿瘤作用;同时,我们也确定了化合物TI150能够明显抑制多种肿瘤细胞中Cripto-1蛋白的表达水平。随后我们对化合物TI150发挥其抗肿瘤作用是否与其抑制肿瘤细胞中Cripto-1蛋白的表达有相关性进行了探讨。我们在He La细胞和SGC7901细胞中过表达Cripto-1蛋白后用化合物TI150处理,并进一步验证化合物TI150的抗肿瘤作用是否受到影响。（1）过表达Cripto-1对目标化合物TI150抑制肿瘤细胞活力的影响我们首先检测了化合物TI150对过表达Cripto-1蛋白的He La细胞和SGC7901细胞活力的影响。结果显示,过表达Cripto-1蛋白以后,化合物TI150对He La细胞和SGC7901细胞活力的抑制作用明显减弱。（2）过表达Cripto-1对目标化合物TI150诱发肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖的影响我们随后从诱发凋亡和抑制增殖两个方面来验证过表达Cripto-1对化合物TI150抗肿瘤作用的影响。我们利用Western blot检测了化合物TI150对过表达Cripto-1蛋白的He La细胞和SGC7901细胞凋亡的影响。结果显示,过表达Cripto-1蛋白后,凋亡标志蛋白Cleaved-caspase-3的表达水平明显下调。同时,Brd U掺入结果显示,过表达Cripto-1蛋白后,He La细胞和SGC7901细胞中Brd U掺入值与对照组相比均有所提高。以上结果说明,过表达Cripto-1蛋白以后,化合物TI150诱导细胞凋亡和抑制增殖的作用明显减弱。（3）过表达Cripto-1对目标化合物TI150调控的肿瘤细胞糖代谢的影响我们前面已经得出化合物TI150能够在一定程度上抑制SGC7901和He La细胞中糖代谢相关蛋白HK2、GLUT1、GLUT4的表达,随后我们检测了过表达Cripto-1蛋白后,He La细胞和SGC7901细胞中糖代谢相关蛋白HK2、GLUT1、GLUT4的变化。结果显示,经化合物TI150作用后,过表达Cripto-1蛋白的He La细胞和SGC7901细胞中,GLUT1、GLUT4、HK2蛋白的表达水平出现一定程度的上调。以上结果说明,过表达Cripto-1蛋白以后,一定程度上逆转了化合物TI150对肿瘤细胞糖代谢的调控作用。综合以上结果,我们得出化合物TI150至少在一定程度上是通过抑制Cripto-1蛋白的表达来发挥其抗肿瘤作用的。4.目标化合物TI150抗肿瘤作用的相关信号通路分析（1）目标化合物TI150对肿瘤细胞MAPK/ERK信号通路的影响我们用Western blot法对大量信号通路关键蛋白进行检测。结果显示,经化合物TI150作用后,He La细胞和SGC7901细胞内ERK蛋白的磷酸化水平明显下降,并且随着化合物TI150作用浓度的增加,ERK蛋白的磷酸化水平降低幅度变大,说明化合物TI150可能通过抑制ERK蛋白的激活来发挥其抗肿瘤作用。（2）MAPK/ERK信号通路在目标化合物TI150抗肿瘤作用中的必要性研究随后我们对MAPK/ERK信号通路是否在化合物TI150抗肿瘤作用中发挥作用进行了探讨。MTT检测、Western blot以及Brd U掺入的结果表明,在SGC7901细胞和He La细胞中中过表达ERK蛋白后,化合物TI150对细胞活力的抑制作用、对凋亡标志蛋白Cleaved-caspase-3的的激活作用以及对细胞增殖的抑制作用均受到抑制。以上结果说明,化合物TI150可以通过抑制MAPK/ERK信号通路来发挥其抗肿瘤作用。（3）MAPK/ERK信号通路与Cripto-1表达的相关性研究化合物TI150可以通过抑制MAPK/ERK信号通路来发挥其抗肿瘤作用。同时,化合物TI150的抗肿瘤作用与其抑制Cripto-1蛋白的表达密切相关。因此,我们接下来对MAPK/ERK信号通路与Cripto-1蛋白表达之间的相关性进行了研究。在SGC7901细胞和He La细胞中过表达Cripto-1蛋白后,ERK蛋白和磷酸化的ERK蛋白水平有了一定程度的增加。同时,在SGC7901细胞和He La细胞中过表达ERK蛋白后,Cripto-1蛋白的表达受到明显抑制。以上结果说明,化合物TI150首先通过抑制Cripto-1蛋白的表达,并进一步抑制MAPK/ERK信号通路来发挥其抗肿瘤作用。综上所述,化合物TI150具有明显的抗肿瘤作用,其可通过抑制MAPK/ERK信号通路诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖,并对肿瘤细胞的糖代谢过程有一定的影响,这与其能够靶向Cripto-1密切相关。本研究为进一步开发以Cripto-1为靶点的抗肿瘤药物提供了一定物质基础。