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糖基化是非常重要的蛋白质翻译后修饰之一。免疫球蛋白属于糖蛋白,其N-糖链存在不均一性,主要结构为双天线型复杂寡糖链。糖链的存在可维持IgG Fc片段的活性构象,不同糖型可调节IgG的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)与补体依赖的细胞毒性作用(CDC),延长其在血清中半衰期。同时糖链的存在提高了IgG分子热稳定性,尤其对其CH2结构域贡献最大。糖链的存在可形成空间位阻效应,遮蔽蛋白酶的酶切位点,提高IgG抗蛋白酶水解的能力。鸡卵黄免疫球蛋白IgY存在糖基化修饰现象,与哺乳动物IgG相比,糖基化位点、糖型结构的不同将对IgY分子的结构与功能产生差异性的作用,本文系统研究了N-糖基化对IgY分子结构稳定性的作用,研究结果如下:1.分离鉴定了IgY,并建立了非变性条件制备去糖基化IgY的方法。经3.5%PEG6000、8.5%PEG 6000两步沉淀可获得粗提IgY。随后通过凝胶过滤色谱法对粗提IgY进一步纯化,在凝胶过滤色谱图中出现单一的分离峰。还原型SDS-PAGE结果表明在70 kDa与25 kDa有两条清晰的条带,经过MALDI-TOF/TOF MS与MASCOT表征,获得IgY轻链与重链水解肽段对应的特征离子峰,得分值在35以上,且肽段覆盖率达到36%以上。经过12%PEG 6000沉淀与凝胶过滤色谱纯化,高效液相表征IgY纯度达到92.01%,满足蛋白质结构研究的纯度要求。考查了PNGase F用量及孵育时间对IgY去糖基化程度的影响。实验发现随着酶用量的提高及孵育时间的延长,经高碘酸-希夫染色的IgY条带颜色逐渐变浅,表明去糖基化完成越彻底。确定去糖基化优化条件为800 NEB unit PNGase F、1 mg IgY 37℃孵育48 h。随后通过阴离子交换色谱技术对去糖基化IgY进行分离富集。2.研究了糖基化修饰对IgY分子结构的影响。傅里叶变换红外光谱显示,去糖基化后1200 cm-1~900 cm-1峰强度显著降低,表明糖链的切除。圆二色光谱结果表明,去糖基化后IgY分子二级结构发生了较显著的变化,α-螺旋结构含量由30.9%降至2.2%,β-折叠由41.8%降至23.3%,β-转角从22.3%升至25%,无规卷曲从5%升至28.5%。内源性荧光光谱结果表明去糖基化后IgY色氨酸微环境极性改变,分子疏水性变强,分子构象由舒展向紧凑状态转变,推测寡糖链的存在维护IgY结构的稳定性。盐酸胍变性实验证明,N-糖链的存在可将IgY抵抗盐酸胍诱导的去折叠能力提高了0.6 M,比IgG的高约0.1 M盐酸胍。以上结果可能是由于IgY比IgG分子糖基化位点多,且分布在IgY的不同区域,因此糖基化修饰对IgY分子结构稳定性作用更大。3.研究了糖基化在热力诱导IgY分子聚合过程中的作用。通过SDS-PAGE与SEC-HPLC分析发现,IgY在55℃孵育6 h时开始产生多聚体,且随着温度的升高多聚体数量快速增加;温度在60℃及以上时随着孵育时间的延长,多聚体的数量显著增加。去糖基化后,IgY在50℃下孵育6.5 h时产生少量的多聚体,且随着温度的升高、孵育时间的延长,IgY多聚体含量快速增加。实验结果表明N-糖基化对提高IgY热稳定性具有重要作用,约5℃;糖链的存在可以延缓热力诱导的IgY分子聚集,这对IgY生产过程中的巴氏杀菌工艺具有重要指导意义。4.优化了胃蛋白酶、木瓜蛋白酶消化IgY产生Fab片段的条件,(1)胃蛋白酶与IgY比例为1:10(w/w),孵育3 h;(2)木瓜蛋白酶与IgY比例为1:10(w/w),孵育3 h。考查了N-糖链对IgY抵抗蛋白酶水解的作用,酶与底物比例为1:40(w/w)时,胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及糜蛋白消化过程中,去糖基化IgY被消化6 h后分子条带消失,但糖基化IgY经相同时间消化后仍存在明显的分子条带;IgY被胰蛋白酶消化90 min后仍有分子条带残留,但去糖基化IgY经90 min消化后分子条带消失,表明糖链的存在提高了IgY抗蛋白酶的水解性。5.分析了糖基化位点、糖型结构以及糖链对IgY分子量的贡献率。检测到两个糖基化肽段:SGSTYSLSSRVNVSGTDWR与PMVLQEHFNGTYSASSAVPVSTQD WLSGER,均为IgY重链肽段。其中SGSTYSLSSRVNVSGTDWR中存在糖基化位点Asn308,肽段PMVLQEHFNGTYSASSAVPVSTQDWLSGER中含有糖基化位点A sn407。IgY的N-糖链包含了两种糖型结构:高甘露糖链、复合型糖链,并以高甘露糖链居多;糖链末端存在唾液酸、半乳糖修饰;糖链分子量5.5922 kDa,占IgY总分子量的3.29%。