随着环境和生活方式的改变,支气管哮喘发病率逐年增加,而以流感为代表的病毒感染引起的非过敏性哮喘也逐渐增多,且常规的皮质类药物对此疗效甚微,因此亟需研究病毒感染等引起的非过敏性哮喘发病过程,寻找潜在治疗方法。同时,流感作为多发的呼吸道疾病,在全球范围内危害较大,目前用于治疗流感的药物主要为神经氨酸酶抑制剂和基质蛋白2 (Matrix protein 2, M2)离子通道阻断剂,但两类药物均存在耐药性逐渐增强和毒副作用等缺点,因此迫切需要研发和评价新型高效抗流感药物。本论文由两部分研究组成。第一部分通过建立H1N1亚型流感病毒诱导小鼠哮喘气道高反应(Airway Hyper-reactivity, AHR)模型,寻找潜在的治疗非过敏性哮喘的有效方法。首先将HlN1亚型流感病毒A/Puerto Rico/8/1934 (PR8)以1.5×103EID5o剂量滴鼻接种小鼠,发现小鼠肺脏内病毒在3dpi达到高峰,约为107EID50/g；呼吸道症状明显,组织病理学变化显著；小鼠血清抗体显著上升;且在5dpi时经乙酰甲胆碱刺激后肺阻力(lung resistance, RL)值可达到基础值的325%,形成典型的气道高反应(Airway Hyper-reactivity, AHR)症状,与公认的过敏性卵清蛋白(Ovalbumin)哮喘气道高反应相似。同样剂量感染Rag2-/-基因敲除小鼠,在感染5天后,Rag2"/-基因敲除小鼠也出现典型的AHR症状。同时发现,支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BAFL) IL-5和IL-13水平显著升高。通过流式细胞技术检测发现,PR8感染Rag24-小鼠后,肺脏ILC2阳性细胞比例为13.4%,显著高于对照组,小鼠肺脏中的ST2 mRNA水平上升3倍,其配体IL-33水平亦显著上升。将重组IL-33蛋白滴鼻给予未感染流感病毒小鼠,结果表明均可形成明显的气道高反应；应用IL-33单克隆抗体腹腔注射于AHR模型小鼠,感染流感病毒后动物未出现典型AHR症状。结果表明IL-33是流感病毒诱导气道高反应过程的重要因子之一,其单克隆抗体可以作为治疗气道高反应的潜在药物。第二部分研究是在体外药物筛选模型基础上,利用流感小鼠感染模型进行体内筛选。首先,运用蛋白重组技术建立体外抗流感药物筛选模型,将金刚烷胺类药物敏感毒株A/Aichi/2/68(Aichi)M2基因表达质粒转化至大肠杆菌,重组细菌加入IPTG同时加入终浓度70uM的盐酸金刚烷胺,11h后OD600值为0.47,未加入药物处理组的OD600值小于0.2,结果表明成功建立敏感型M2离子通道体外筛选模型。对7种候选抗流感药物以终浓度70uM加入体外筛选模型,结果表明其中3种药物A21、A189和A193具有体外抗流感病毒能力。为了进一步验证候选药物A21、A189和A193体内抗流感效力,用10LD50的流感病毒Aichi株建立体内筛选模型。结果表明,候选药物A193以100mg/kg/d剂量给药可以显著提高小鼠存活率;以50 mg/kg/d和10mg/kg/d剂量给药,可使动物模型存活率分别达到100%和80%。七种候选药物在体内、外均未表现出抵抗耐药性流感病毒的能力。结果表明,候选药物A193是潜在的M2离子通道抑制剂。综上所述,本论文建立了流感病毒诱导小鼠产生气道高反应模型,并运用该模型发现了IL-33是流感病毒诱导产生气道高反应的关键因子,且IL-33单克隆抗体对小鼠哮喘AHR症状具有缓解或治疗效果;建立了流感病毒M2蛋白离子通道融合表达细菌模型,并对候选药物进行了初步筛选;在体外试验基础上,利用小鼠体内药物筛选模型,发现了1种具有潜在抑制金刚烷胺类药物敏感型毒株的药物,为将来进一步研发奠定了基础。