骨骼与肌肉的生长是肉鸡生产中最需要关注的内容,肉鸡产业者一直在试图提高鸡肌肉的生长速度和产肉能力。肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）在骨骼肌发育过程中起重要作用,可以负调控肌肉生长,因此通过敲除该基因很可能使肌肉生长加快。肌细胞增强因子2（myocyte enhancer factor 2,MEF2）在骨骼肌发育过程中起关键作用,正调控肌肉生长,因此可以通过插入该基因达到促进肌肉生长的目的。该实验以鸡rDNA基因的间隔重复序列为靶位点,插入MEF2c基因,可使MEF2c基因位于活跃的转录单位内,使MEF2基因稳定表达;同时敲除MSTN基因。为探讨基因编辑肉鸡生长基因对鸡生长的意义奠定基础。该课题在鸡的核糖体rDNA基因间的内部转录间隔序列中,确定了适合g RNA识别并通过Cas9进行切割的位点,根据g RNA的序列特征,设计了g RNA序列。构建同时表达Cas9的真核表达载体。在g RNA识别的rDNA靶位点的两侧分别设计并扩增两条基因打靶载体上下游同源引导序列DS1和DS2,将DS1和DS2分别插入合成好的pEGFP-MEF2c载体中,构建pEGFP-DS1-MEF2C-DS2基因打靶载体。对于需要敲除的MSTN基因,运用g RNA设计网站针对其CDS区设计g RNA序列,构建Cas9真核表达载体。将针对rDNA基因的g RNA-Cas9真核表达载体和MEF2基因打靶载体、针对MSTN基因的g RNA-Cas9真核表达载体分别转染鸡成纤维细胞,细胞中绿色荧光蛋白表达,检测基因剪切、插入情况。结果显示本实验成功构建MSTN基因Cas9敲除载体、rDNA基因Cas9真核表达载体和MEF2c基因打靶载体。MSTN基因敲除的实验中将Cas9表达载体转染鸡成纤维细胞,72小时后扩增识别位点序列,通过测序初步判断Cas9可以准确切割基因组DNA,比对发现Cas9识别序列附近片段有碱基突变,16个测序样中6个发生突变,剪切效率37.5%。而对rDNA的编辑实验中,25个测序样9个发生突变,效率36%。在MEF2c基因打靶载体对基因整合的有效性检测中,发现基因有整合。定点整合检测发现MEF2c基因有定点整合。综上所述,在鸡成纤维细胞中成功敲除MSTN基因,定点插入MEF2c基因。