广州管圆线虫病是一种自然疫源性疾病，其病原体为广州管圆线虫，该病已被卫生部列为新发传染病之一。人为该虫的非适宜宿主，常因生食、半生食含有Ⅲ期活幼虫的淡水螺肉而感染。幼虫侵入人体后主要移行到中枢神经系统，引起以嗜酸粒细胞浸润为主的中枢神经系统炎症反应，造成对神经元的损伤，其病变多累及大脑、小脑、脑干、脊髓等，脑脊液中嗜酸粒细胞增高明显，故称为嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎。感染严重时致患者死亡或留下后遗症。我国台湾、广东、广西、云南、福建、浙江、海南、湖南及江西先后报道发现该病的自然疫源地。近年来，浙江、福建、云南及北京先后出现该病的群体爆发事件。广州管圆线虫病的扩散与流行是我国公共卫生面临的新问题。由于中间宿主福寿螺及褐云玛瑙螺的大量养殖与食用，加上气候变暖，导致该病的向北扩散，防治难度加大。该病发生与饮食习惯有关，常发生爆发事件，且感染后主要造成中枢神经系统的损伤，危害严重。目前对该病的研究尚不系统和深入，为此有必要进一步加强相关基础研究工作，为关键防治技术的研制应用提供理论支撑和新思路。 嗜酸粒细胞活性产物如ECP具有较强的细胞毒性，嗜酸粒细胞活性产物可能为该病的致病因素。嗜酸粒细胞活化因子除IL5已见报道之外，其它活化因子如C5a及LTB4尚未见报道。C5a及LTB4同时也是重要的炎症因子。因此有必要进一步开展嗜酸粒细胞活性产物及活化因子的研究，有助于进一步了解该病的发病机制。如何预防虫体杀死后其虫体组分在脑部引起的超敏反应是广州管圆线虫病治疗过程中需要解决的问题，目前有采用抗寄生虫药物与激素类药物联合用药的方案，但激素类药物存在许多副作用，寻找替代药物是目前的研究热点。本课题在国家“863”项目基金的资助下，开展了广州管圆线虫遗传多态性及其对不同宿主的易感性研究，感染小鼠嗜酸粒细胞活化相关因子的检测，阿苯达唑联合黄芩素对广州管圆线虫病治疗效果的实验研究。 第1章广州管圆线虫的生物学特性研究 目的： 分析来源于不同地理环境的广州管园线虫株的CO1和ITS2基因以及PCR—ISSR的多态性，了解广州管圆线虫的遗传多态性。比较广州管圆线虫广州株在中间宿主褐云玛瑙螺和福寿螺螺体内的发育情况及对非适宜宿主BALB/c小鼠和昆明小鼠的毒力，为建立实验室广州管圆线虫生态系统和实验动物模型提供依据。 方法： 从海口、南宁、广州、福州及温州采集褐云玛瑙螺或福寿螺，从中分离幼虫感染鼠类后收集虫体或直接从家鼠中分离成虫。采用PCR扩增CO1及ITS2的DNA片段，T—A克隆后测序，序列对齐分析、构建遗传树，并进行SSCP分析。同时进行PCR—ISSR扩增，产物通过琼脂糖电泳直接进行分析不同地区来源的广州管圆线虫是否存在基因多态性。同时，连续7d分别用感染大鼠的粪便喂食实验室传代的福寿螺和褐云玛瑙螺，1个月后解剖感染螺，观察螺体内广州管圆线虫幼虫的发育及虫数；从褐云玛瑙螺和福寿螺分离广州管圆线虫Ⅲ期幼虫(L3)分别感染昆明鼠；而感染BALB/c小鼠的Ⅲ期幼虫来自于褐云玛瑙螺。通过观察感染小鼠的死亡率、体重变化、MMP—9活性、脑组织的病理变化、脑内虫体数及脑脊液总蛋白含量等指标评价不同宿主来源幼虫的致病力。 结果与分析： 来自同一地区的广州管园线虫虫株CO1及ITS2序列一致，PCR—ISSR条带相同。广州、南宁及福州来源的虫株ITS2序列一致。温州虫株ITS2与前三者相差2个碱基，遗传距离为0.00791。海口虫株与广州株相差1个碱基，遗传距离为0.00395。中国大陆虫株与菲律宾虫株相比相差1～2个碱基，遗传距离为0.00797及0.00396。中国大陆虫株与日本虫株相比相差3～6个碱基，遗传距离最远。用系统发育的方法分析可将其分为5支：广州、南宁及福州来源的虫株为1支，海口来源虫株为1支，温州来源的虫株为1支，菲律宾虫株为1支，日本虫株为1支。广州、南宁及福州虫株CO1序列一致，温州虫株与海口虫株显示出差异，广州株与温州株的遗传距离为0.03315，广州株与海口株的遗传距离为0.01652，温州株与海口株的遗传距离为0.1381。用系统发育的方法分析15个CO1序列，可将其分为3支：广州、南宁及福州的虫株为1支，海口虫株及温州虫株各为1支。PCR—ISSR的带型可分为3种，与CO1分支一致。幼虫在褐云玛瑙螺及福寿螺中的发育无显著性差异，但褐云玛瑙螺感染的幼虫数量高于福寿螺。BALB/c小鼠感染广州管圆线虫后其死亡率、MMP—9活性、脑内虫体数及脑脊液总蛋白含量等明显高于昆明小鼠，其体重减轻、病理变化也更明显。用不同螺来源的Ⅲ期幼虫感染的昆明小鼠其MMP—9活性、脑内虫体数、脑脊液总蛋白含量、体重减轻及脑组织病变程度均无显著差异。 结论： 根据广州管圆线虫CO1及ITS2基因序列以及PCR—ISSR结果提示广州管圆线虫存在基因多态性。我国的广州管圆线虫至少存在3个地理株，即广州株、海口株和温州株。同一地区不同宿主来源的广州管圆线虫的遗传背景一致。褐云玛瑙螺与福寿螺对广州管圆线虫均易感，且不同宿主来源的广州管圆线虫Ⅲ期幼虫对昆明小鼠的毒力无差异。BALB/c小鼠感染后，其病理变化比昆明小鼠更明显，提示其更适合作为广州管圆线虫病的动物模型。 第2章广州管圆线虫所致嗜酸性脑炎的相关机制研究 目的： 分析Eotaxin、C5a、LTB4及嗜酸粒细胞与嗜酸粒细胞活性产物ECP的关系，深化广州管圆线虫致嗜酸粒细胞活化的分子机制的认识。评价黄芩素联合阿苯达唑对小鼠广州管圆线虫病的治疗效果，观察黄芩素能否下调嗜酸粒细胞数量及Eotaxin水平，为优化广州管圆线虫病的治疗方案提供实验依据。 方法： 收集不同感染时期的小鼠血清和脑脊液；Western blot定性检测C5a，ELISA定量检测C5a；采用ELISA测定LTB4和ECP的水平；计数脑脊液中淋巴细胞和嗜酸粒细胞；统计分析这些指标在感染小鼠与对照小鼠之间以及感染小鼠不同时期之间的差别，并分析Eotaxin、C5a、LTB4及嗜酸粒细胞与嗜酸粒细胞活性产物ECP的关联性。建立小鼠(BABL/C)感染模型，在小鼠感染后5d或15d给予黄芩素与阿苯达唑的联合用药治疗，同时设药物单用、感染对照及健康对照组。通过小鼠生存率(生存时间)、体重变化、神经功能评分变化等指标的比较，以及小鼠脑脊液中MMP—9活性、Eotaxin水平、总蛋白含量、淋巴细胞和嗜酸粒细胞数量的检测，评价治疗效果。 结果与分析： 感染小鼠血清及脑脊液中C5a、Eotaxin、嗜酸粒细胞和ECP均显著高于对照组小鼠。脑脊液中ECP与C5a在感染后16d达高峰。C5a、Eotaxin、嗜酸粒细胞均与ECP成正比。脑脊液中LTB4未见显著增高，与ECP无相关性。单用阿苯达唑的疗效与治疗时间密切相关，早期治疗或联合治疗可改善小鼠体重及神经功能，死亡率也低于晚期治疗，并可减少虫荷，下调Eotaxin水平、MMP—9活性、总蛋白含量、淋巴细胞和嗜酸粒细胞数量。但单用黄芩素也可下调嗜酸粒细胞数量及Eotaxin水平。而阿苯达唑联合黄芩素则无论是早期还是晚期均显示出良好的疗效。联合用药小鼠体重及神经功能明显改善，相对于晚期单用阿苯达唑治疗组其生存时间也明显延长。嗜酸粒细胞数量及Eotaxin水平也出现了明显下调。 结论： 感染广州管圆线虫小鼠的脑脊液中存在高水平的嗜酸粒细胞的活化产物ECP及其活化因子C5a。ECP与嗜酸粒细胞数量及Eotaxin成正比。黄芩素能下调广州管圆线虫感染小鼠脑脊液中的嗜酸粒细胞数量及Eotaxin，可能是阿苯达唑联合黄芩素较单用阿苯达唑的疗效更佳的主要原因。 钩体病是广泛传播的自然疫源性疾病。人类常通过接触疫水或被污染土壤而感染。感染后可导致肝、肾、肺及脑等多器官损害，危害严重。目前使用的灭活全菌疫苗可保护机体抵抗一些常见钩体型别的感染，但作用短暂且缺乏交叉保护作用。 研究目的： 观察pcDNA3.1(+)-lipL21在豚鼠体内所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平，评价其对豚鼠抗赖型钩体的免疫保护作用，为研制新型钩体疫苗提供实验基础。 研究方法： 从赖型钩体56601株中扩增出全长lipL21基因，亚克隆入pcDNA3.1(+)，构建pcDNA3.1(+)—lipL21重组质粒。将其转染Cos—7细胞，用免疫组化及Western Blot分析鉴定lipL21在细胞中的表达。用pcDNA3.1(+)—lipL21免疫豚鼠。末次免疫2w后，一半豚鼠被处死后分离豚鼠脾脏淋巴细胞，通过淋巴细胞转化试验探测其活化能力。显微镜凝集试验(MAT法)定量检测特异性抗体水平。另一半豚鼠以56601株钩体从腹腔攻击。比较豚鼠的临床症状。肺、肝、肾做病理切片观察病理变化，评价pcDNA3.1(+)—lipL21对豚鼠的免疫保护效果。 结果与分析： 成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)—lipL21。重组质粒转染Cos—7细胞能在细胞中表达。免疫豚鼠的特异性抗体及淋巴细胞刺激指数增高。被攻击免疫豚鼠的肝、脾及肾未出现明显的病理改变及临床症状。 结论： pcDNA3.1(+)—lipL21核酸疫苗能诱导豚鼠产生特异性免疫保护力，提示pcDNA3.1(+)—lipL21核酸疫苗具有进一步研究价值。