论文部分内容阅读
目的:本文将已构建好的SA-hGM-CSF质粒转化入大肠杆菌诱导表达、通过采用发酵罐发酵，Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析纯化、尿素梯度透析复性等方法，制备出链亲和素标记hGM-CSF的融合蛋白，并研究其生物学功能以及一级结构，为后期的动物实验及肿瘤疫苗的研制奠定基础。
方法:
1.诱导表达SA-hGM-CSF融合蛋白将已建好的SA-hGM-CSF重组质粒转化到用CaCl2方法制备的Rosetta感受态细胞中进行过夜活化，挑单克隆菌落，筛选出高表达菌株，二次活化，IPTG诱导表达，高压破碎仪破菌，采用本实验室已成功研制的包涵体洗涤方法洗涤包涵体。用SDS-PAGE分析检测上清及包涵体表达产物。
2.SA-hGM-CSF融合蛋白的发酵发酵是一个复杂的过程，选择优良的菌株是发酵的第一步，菌体的性质影响其生长和产物的表达，根据Rosetta细菌的性质将发酵培养基的成分进行优化分析，并对接种量，培养基的pH值，IPTG诱导浓度及时间进行优化。通过发酵系统对整个发酵过程（温度，pH，溶氧量）进行监控。
3.SA-hGM-CS融合蛋白的纯化与复性工程菌收集，通过高压破碎仪破菌收得包涵体后，洗涤后的包涵体用6M盐酸胍溶解，再用平衡液稀释1倍，进行镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化得到融合蛋白，将融合蛋白进行透析复性。
4.细胞锚定和实验细胞增殖实验将复性的SA-hGM-CSF融合蛋白稀释成不同的浓度，体外检测是否对TF-1细胞有增殖效应，应用流式细胞仪检测SA-hGM-CSF融合蛋白对已生物素化的前列腺癌细胞的锚定率。
5.一级结构的测定通过SDS-PAGE，胶内酶切得到样品进行质谱鉴定SA-hGM-CSF融合蛋的分子量。
结果:
1.诱导表达SA-hGM-CSF融合蛋白将重组质粒SA-hGM-CSF转化大肠杆菌，经筛选后获得高表达工程菌，SDS-PAGE显示，融合蛋白分子量的位置大约在36KD左右。IPTG诱导的最佳终浓度0.3mmol/L，诱导时间4h，蛋白以包涵体形式表达。
2.SA-hGM-CSF融合蛋白的发酵使用优化的培养基，发酵培养基为蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，K2HPO41.5 g/L，KH2PO44.0 g/L,Na2HPO45 g/L,MgSO40.6 g/L，甘油(5％)50ml/L,NH4CL0.4g/L，在1∶50的接种量，pH值为7.0，溶氧30％的条件下一次性可得到湿菌140g和包涵体85g。
3.SA-hGM-CS融合蛋白的纯化与复性洗涤后的包涵体用6M盐酸胍溶解，经镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化后，用凝胶扫描仪检测其纯度为97％，透析复性后融合蛋白主要以多聚体形式存在。
4.细胞锚定和细胞增殖实验将复性的SA-hGM-CSF融合蛋白调整不同浓度，用CCK8法发现从0.01-156.25ng/ml不同浓度的SA-hGM-CSF有增殖TF-1细胞的活性且成剂量依赖效应;流式细胞仪检测SA-hGM-CSF融合蛋白与经生物素化的前列腺癌细胞锚定率达到94.9％。
5.一级结构的测定将已酶切好的SA-hGM-CSF融合蛋白，应用ESI-Ion trap质谱检测SA-hGM-CSF融合蛋白分子量，其分子量为35922D。
结论:本文成功的将质粒SA-hGM-CSF导入大肠杆菌中并通过诱导表达方法获得大量工程菌和包涵体，通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化后，透析复性获得高纯度和高浓度的融合蛋白，在体外细胞增殖实验中初步检测SA-hGM-CSF双功能融合蛋白具有生物学活性。为后期的肿瘤疫苗及临床前实验奠定基础。