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背景胶质瘤是最常见的脑恶性肿瘤,具有恶性增殖、浸润性生长等生物学特性,临床治疗效果差。抑制肿瘤细胞增殖、抗浸润性和抗血管生成是治愈胶质瘤的焦点。PEX是新近发现的一种人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)自身催化降解的片段,它对胶质瘤的增殖、血管形成以及侵袭性都有强大抑制作用,能够干预恶性胶质瘤的侵袭行为。MSCs是近年来干细胞研究领域中引人注目的一种成体干细胞,具有多向分化潜能,具有较弱的免疫原性和免疫调节功能、强大的迁移力和趋瘤性等优点,作为一种靶向肿瘤治疗的新型载体,其在胶质瘤基因治疗中具有很好的应用前景。本实验在成功分离、培养、鉴定大鼠MSCs和构建pEGFP-C1-PEX真核表达载体的基础上,将重组质粒转染MSCs,并检测其瞬时转染效率,为进一步的体内外实验研究PEX修饰的MSCs对胶质瘤的治疗作用奠定基础。目的(1)探讨成体MSCs的体外培养方法并研究培养细胞的生物学行为特征,建立体外分离培养MSCs程序方法,为进一步实验和临床应用提供基础;(2)构建PEX基因真核表达载体pEGFP-C1-PEX,并用其转染MSCs,检测其瞬时转染效率,探讨外源基因转染MSCs的可行性:(3)确定获取稳定转染细胞所需的G418筛选浓度,为进一步实验需要做准备。方法(1)采用全贴壁细胞分离法分离大鼠骨髓间质干细胞,体外培养扩增,倒置相差显微镜下观察细胞形态特点,传代培养后流式细胞术鉴定细胞表面分子标记物的表达;(2)采用Trizol试剂提取C6胶质瘤细胞株(高表达PEX)总RNA,RT-PCR扩增目的基因,扩增产物经核酸纯化、酶切、连接等步骤克隆到pEGFP-C1载体中,经DH5α感受态细胞转化,小提质粒,酶切鉴定,测序验证;(3)采用高转染效率的Lipofectmine2000将质粒pEGFP-C1-PEX转染于增殖中的MSCs细胞。通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,并用半定量RT-PCR法检测其瞬时转染效率;(4)通过预实验确定获得稳定转染细胞所需的G418筛选浓度。结果(1)大鼠MSCs的生物学特征及鉴定:细胞主要呈“成纤维样”。CD90、CD105呈阳性表达,CD45阴性,提示MSCs分离培养成功;(2)pEGFP-C1-PEX真核表达载体构建成功;(3)重组质粒转染大鼠MSCs24后小时可见EGFP表达,提示载体基因转染入靶细胞内;(4)转染前/后PEX基因在大鼠MSCs中表达情况的检测:瞬时转染pEGFP-C1-PEX质粒的MSCs的PEX mRNA表达增高;(5)经预实验确定G418筛选浓度:300ng/ml为第9天细胞全部死亡的最低浓度,以400ng/ml定为进一步实验获取稳定转染细胞的筛选浓度。结论(1)建立了稳定的大鼠MSCs体外培养体系,按照此培养体系进行培养可以成功获得大鼠MSCs;(2)成功构建了携带有PEX基因的pEGFP-C1-PEX真核表达载体,可以用于转染大鼠MSCs;(3)用所构建的pEGFP-C1-PEX真核表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞,转染效率约为20%;(4)本实验将pEGFP-C1-PEX真核表达载体成功转染大鼠MSCs,而且确定获得稳定转然细胞的G418筛选浓度,为后续的实验奠定了坚实的基础。