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目的1.初步阐明自体髓核(nucleus pulposus,NP)移植诱导的成年大鼠下肢痛觉过敏中背根神经节(DRG)神经元上电压门控性钠通道(VGSCs)的表达和功能的变化特征。2.探讨胱硫醚-?-合成酶(CBS)在下肢痛觉过敏中的作用及其对电压门控性钠通道表达和功能调控的影响。方法1.选择成年SD雄性大鼠随机分为LDH组和Sham组,LDH组在左侧L5、L6背根神经节处以自体尾椎髓核移植来建立大鼠腰椎间盘突出模型,Sham组仅暴露L5、L6神经根,其他处理与LDH组相同。测量两组大鼠术前及术后7天,14天,21天的左后肢机械刺激缩足反射阈值(PWT)和热刺激缩足反射阈值(PWL)的变化。鞘内注射CBS拮抗剂羧甲基羟胺半盐酸(AOAA),同样运用以上PWT、PWL测量方法评测大鼠的下肢疼痛反射阈值,从而检测CBS在LDH模型中的作用。2.运用逆行标记的荧光素(Di I)来标记支配后肢的L5-L6背根神经节(DRG)中、小神经元,运用全细胞膜片钳方法研究LDH大鼠L5-L6 DRG神经元兴奋性及电压门控性钠通道电流的变化特性。3.运用Western Blotting方法检测大鼠L5-L6 DRG神经元中Na V1.7,Na V1.8以及CBS蛋白表达情况。4.运用免疫组织化学检测LDH大鼠L5-L6 DRG神经元中CBS和Na V1.7,Na V1.8蛋白共表达情况。结果1.自体髓核移植明显增加大鼠下肢痛觉过敏,机械刺激缩足反射阈值(PWT)在术后1周至3周显著低于Sham组,1周时达到疼痛阈值的最低值,热刺激缩足反射阈值(PWL)在术后1周时显著降低,2周时基本恢复到原基线水平,并且PWT和PWL的显著降低与CBS的表达上调相关联;鞘内注射CBS的拮抗剂AOAA后,可以显著翻转LDH大鼠疼痛阈值,并呈现时间和剂量依赖性。2.全细胞膜片钳记录显示,与Sham组相比,LDH组L5-L6 DRG神经元兴奋性显著增加;进一步检测显示自体髓核移植后电压门控性钠通道的电流密度显著增加。3.数据分析后显示,与Sham组相比,LDH组的失活曲线显著左移,激活曲线没有显著变化。另外,自体髓核移植处理后,电压门控性钠通道的失活时间显著增长,激活时间没有显著变化。4.运用免疫组化的实验方法检测后发现CBS与Na V1.7,Na V1.8在L5-L6神经元中能够共表达。自体髓核移植大鼠L5-L6 DRG神经元中Na V1.7和Na V1.8受体蛋白表达显著增加,与移植无关的T10-T12 DRG神经元Na V1.7和Na V1.8的蛋白表达水平没有显著差异。5.连续鞘内注射AOAA可以显著翻转LDH组大鼠L5-L6相关DRG神经元的兴奋性,还可以显著降低电压门控性钠通道的电流密度,并使电压门控性钠通道的失活曲线右移。另外AOAA还可以显著降低LDH组大鼠L5-L6相关DRG神经元中Na V1.7和Na V1.8的高表达。结论以上实验结果表明硫化氢合酶CBS可能是通过电压门控性钠通道的激活和Na V1.7和Na V1.8蛋白的高表达,增加电压门控性钠通道电流密度,导致自体髓核移植处相关DRG神经元兴奋性的增加进而参与外周痛觉信号的调制,最终导致大鼠下肢痛觉过敏。本研究在一定程度上揭示了LDH病人疼痛产生的部分分子机制,可能会为LDH的治疗提供一些有效的治疗方案。-?-