论文部分内容阅读
硬皮病是一种原因不明的、临床上以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征的结缔组织病,除皮肤受累外,也可影响内脏、心、肺和消化道等器官。到目前为止,发病机制尚未完全明了,临床上也无特效的治疗方法,早期治疗的目的在于阻止新的皮肤和脏器受累,晚期治疗的目的在于改善已有的症状。UVA1(340～400nm)光疗法是近年来新发展的物理疗法,对特应性皮炎、硬皮病、蕈样肉芽肿等多种皮肤病均有较好的疗效,但其作用机制尚未完全明了,可能与其调节人体的免疫功能、诱导T细胞凋亡有关。国外学者报道的治疗方案并不统一,在治疗剂量上尚存在争议,但却一致肯定了UVA1治疗该病的疗效,特别是皮肤症状的改善。为了进一步寻找合适的照射剂量,本实验通过建立硬皮病的鼠模型,比较不同剂量的UVA1照射后皮肤硬化程度的改善,皮肤厚度、羟脯氨酸和胶原含量的变化,以及与血管内皮细胞相关因子的变化,为临床选择合适的光疗方案提供理论基础。第一章硬皮病动物模型的建立目的用博来霉素诱发建立相对稳定的小鼠硬皮病动物模型,为下一步实验做好准备。方法选用SPF级、雌性、6周龄、体质量18～22 g的BALB/c小鼠20只,随机分为造模组和对照组,每组各10只。造模组小鼠背部皮下注射100UL 400μg/ml的博来霉素,每日一次,共28天。实验结束后观察并比较两组小鼠的皮肤、组织病理、皮肤厚度和胶原含量的变化。结果造模组小鼠注射部位皮肤明显增厚、弹性变弱、无毛发生长,对照组小鼠皮肤红润、表皮很薄、弹性佳,毛发亮而有光泽。造模组小鼠皮肤组织学显示真皮层厚度增加,真皮上部胶原纤维明显增多,胶原纤维束粗大、排列紧密、红染,平均皮肤厚度10.68±2.29μm;对照组小鼠皮肤组织学显示皮肤较薄,胶原纤维较少,皮下组织疏松,平均皮肤厚度6.96±0.64μm,两者比较差异有统计学意义(t=4.945,P＜0.001)。造模组羟脯氨酸和胶原含量分别为5041.10±1720.92μg/mg湿重、37606.61±12838.04μg/mg蛋白,对照组为2094.40±586.01μg/mg湿重、15624.22±4371.63μg/mg蛋白,两者比较,差异有统计学意义(t=3.712,P＜0.01)。结论博来霉素可以诱发并建立相对稳定的硬皮病鼠模型。第二章不同剂量UVA1辐射对硬皮病鼠模型皮肤影响的实验研究目的比较不同剂量的UVA1辐射硬皮病鼠模型后皮肤厚度和胶原含量的变化,为临床治疗硬皮病寻找合适的照射剂量。方法用100UL 400μg/ml的博来霉素皮下注射BALB/c小鼠背部,共28天,建立硬皮病的小鼠模型,然后将小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、UVA1照射组(大、中、小剂量)及阴性对照组。每周照射3次,共10周,观察并比较各组小鼠皮肤组织病理改变、皮肤厚度和胶原含量的变化。结果模型对照组与空白对照组相比,皮肤厚度(t=4.945,P＜0.001)和胶原含量(t=3.712,P＜0.01)的差异均有统计学意义。UVA1照射组小鼠皮肤变软、变薄,但只有HD-UVA1组小鼠皮肤厚度、胶原含量与模型对照组、阴性对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);照射组之间相互比较,皮肤厚度差异F=14.853,P＜0.01,胶原含量差异F=6.317,P＜0.01,尤其是HD-UVA1与MD-UVA1和LD-UVA1之间有显著差异。结论HD-UVA1照射能明显改善博来霉素所致的硬皮病鼠模型的皮肤厚度、胶原含量的变化,可能与其抑制皮肤的胶原增生、降低胶原含量有关。第三章不同剂量的UVA1辐射对硬皮病鼠模型血管内皮细胞的影响目的比较不同剂量的UVA1辐射对硬皮病鼠模型皮肤匀浆中CD34和M30的影响,初步探讨UVA1光疗对硬皮病血管内皮细胞(VEC)功能的影响。方法用100UL400μg/ml的博来霉素皮下注射BALB/c小鼠背部,共28天,建立硬皮病的小鼠模型;然后将小鼠随机分为模型对照组、UVA1照射组(大、中、小剂量)及阴性对照组,每周照射3次,共10周。治疗结束后比较各组小鼠皮肤匀浆中CD34和M30含量的变化。结果①与造模组相比,CD34的变化仅有HD-UVA1组差异有统计学意义(t=6.753,P＜0.001);M30的变化在所有UVA1照射组之间均有差异。②与阴性对照组相比,CD34的变化在LD-UVA1组并无明显差异,MD-UVA1组和HD-UVA1组差异有统计学意义;M30的变化仅有HD-UVA1组差异有统计学意义(t=6.413,P＜0.001)。③不同剂量的UVA1照射组之间采用单因素方差分析,F=15.315,P＜0.001,说明三组之间有差异;两两比较时(S-N-K),HD-UVA1与MD-UVA1和LD-UVA1比较有显著差异(P＜0.05)。结论UVA1光疗法可以通过上调CD34,使血管生成增多;并抑制血管内皮细胞的凋亡等调节血管内皮细胞的功能,改善临床症状,且其疗效与照射强度、累积剂量有关,HD-UVA1的疗效较LD-UVA1和MD-UVA1更加明显。第四章UVA1辐射对人成纤维细胞胶原代谢影响的研究目的比较不同剂量的UVA1辐射对人成纤维细胞增殖能力和胶原代谢的影响。方法采用原代分散细胞培养法进行成纤维细胞的培养,待其融合达90%以上时,制备成细胞悬液,以3×10~5个细胞/mL接种至96孔板和24孔板,细胞长成单层后分别予100J/cm~2、60 J/cm~2、20 J/cm~2UVA1照射,同时设空白对照组。照光后0h、24h、48h在倒置显微镜下观察成纤维细胞的形态变化、MTT法检测细胞的增殖能力、消化法测定细胞内羟脯氨酸和胶原含量的变化。结果UVA1照射组的细胞全部出现细胞间隙增宽、突起缩短、胞浆减少、细胞变圆、破碎等变化,以HD-UVA1组破坏最大。单一剂量的UVA1照射对细胞的增殖能力、羟脯氨酸及胶原含量均有明显的抑制作用,与正常对照组相比,差异有统计学意义,P＜0.001;这种抑制作用在24h最明显,48h逐渐恢复。在相同的时间点,不同剂量的UVA1照射对细胞的增殖能力、羟脯氨酸及胶原含量的抑制作用呈剂量依赖性,剂量越大,抑制作用越强。照射组之间两两比较,差异有统计学意义,P＜0.001。结论UVA1照射对人成纤维细胞的增殖、羟脯氨酸和胶原含量均有抑制作用,并且呈剂量依赖性,剂量越大,抑制作用越明显;UVA1照射后胶原含量的降低可能与成纤维细胞数目的减少、活性降低,以及本身可以抑制胶原的合成有关。