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目的:矽肺病（silicosis）是由于在职业生产过程中暴露并吸入大量游离的二氧化硅（Si O2）所致的以弥漫性肺纤维化和矽结节为特点的肺部疾病。在Si O2刺激下巨噬细胞合成并释放促炎因子和趋化因子,并伴随着巨噬细胞的程序性死亡。环状RNA（circular RNAs,circ RNAs）是一种广泛参与了各种疾病发生发展过程的新型非编码RNA,但在矽肺进程中的作用机制仍然有待深入研究。本研究旨在探讨外泌体circ RNA11:120406118|12040782在Si O2诱导的炎症纤维化模型中的作用机制。在细胞水平探索circ RNA11:120406118|12040782通过竞争性结合mi R-30b-5p调控NLRP3介导的巨噬细胞焦亡;在体内实验中,研究circ RNA11:120406118|12040782竞争性抑制的mi R-30b-5p在小鼠矽肺发生发展中的作用,从而为矽肺炎症纤维化的诊断与治疗提供新的思路和理论依据。研究方法:本研究通过收集矽肺患者和健康人外周血血清外泌体,进行全转录组测序以及生物信息学分析,筛选差异表达的circ RNA11:120406118|12040782和mi R-30b-5p,构建circ RNA11:120406118|12040782、mi R-30b-5p和NLRP3的ce RNA机制,即circ RNA11:120406118|12040782通过抑制mi R-30b-5p从而上调NLRP3。通过体外培养巨噬细胞并进行Si O2处理,使用核酸电泳、酶耐受实验和Realtime-PCR对筛选出的差异表达的circ RNA进行特性鉴定和ce RNA关系验证。通过FISH对circ RNA11:120406118|12040782在细胞中的表达进行定位;通过对THP-1细胞转染靶向敲减circ RNA11:120406118|12040782的小干扰RNA（si-RNA,small interfering RNA）和mi R-30b-5p的抑制剂,进一步验证ce RNA关系。通过Western blot、casepase-1活性检测实验和Annexin V-FITC/PI染色并用流式细胞术检测的方法验证了circ RNA11:120406118|12040782通过作用mi R-30b-5p影响NLRP3介导的巨噬细胞焦亡。以上实验说明了circ RNA11:120406118|12040782影响巨噬细胞焦亡和炎症因子释放的作用机制。将处理后的THP-1细胞的培养上清作用于MRC-5细胞,并使用Realtime-PCR和Western blot检测成纤维细胞纤维化相关因子的基因和蛋白表达水平,说明circ RNA11:120406118|12040782能通过外泌体通讯方式介导成纤维细胞活化。采用非气管暴露式灌注二氧化硅悬液,构建雄性C57BL/6小鼠矽肺模型,应用搭载ov-mi R-30b-5p的6型腺相关病毒（AAV6）建立小鼠肺部mi R-30b-5p过表达模型。将小鼠按体重随机地分为六组:生理盐水组（saline）、矽肺组（Si O2）、空病毒生理盐水组（saline+AAV-NC）、空病毒矽肺组（Si O2+AAV-NC）、过表达生理盐水组（saline+AAV-ov-mi R-30b-5p）、过表达矽肺组（Si O2+AAV-ov-mi R-30b-5p）。通过免疫荧光、Realtime-PCR检测mi R-30b-5p过表达病毒的转染效果;利用小鼠肺组织表面照片以及HE染色观察各组病理情况;利用ELISA和Realtime-PCR法检测肺泡灌洗液（BALF）中各细胞因子的分泌情况以及肺组织内相应因子的转录水平;通过对小鼠肺组织羟脯氨酸含量的测定和肺组织切片的Masson染色检验,反映过表达mi R-30b-5p对小鼠矽肺模型胶原沉积情况的影响;用Western blot、免疫荧光和免疫组化对肺组织内各焦亡和炎症纤维化指标的蛋白水平进行检测。以上实验均用以说明过表达mi R-30b-5p对矽尘引起的肺部纤维化的调控作用。结果:1、矽肺患者血清外泌体中circ RNA表达谱及差异表达circ RNA的验证。通过对矽肺患者和健康对照的全转录组测序筛选出一条表达水平显著上调circ RNA,即circ RNA11:120406118|12040782。通过核酸电泳、酶耐受实验验证其具有环状RNA的特性。通过生物信息学分析预测circ RNA11:120406118|12040782靶向mi R-30b-5p,Realtime-PCR初步验证circ RNA11:120406118|12040782、mi R-30b-5p和NLRP3存在的ce RNA表达关系。2、circ RNA11:120406118|12040782在细胞内的分布特征和双荧光素酶报告实验。通过荧光原位杂交技术检测circ RNA11:120406118|12040782在THP-1细胞中的定位,检测出circ RNA11:120406118|12040782在细胞核和细胞质中均有表达。通过双荧光素酶报告实验进一步验证了circ RNA11:120406118|12040782和mi R-30b-5p以及mi R-30b-5p和NLRP3之间的两两结合关系。3、circ RNA11:120406118|12040782吸附mi R-30b-5p调控NLRP3影响Si O2诱导的巨噬细胞炎性因子的分泌。对THP-1细胞转染靶向敲减circ RNA11:120406118|12040782的si-RNA和mi R-30b-5p的抑制剂,加入Si O2进行刺激12h后收集THP-1细胞并使用Realtime-PCR检测。当敲减circ RNA11:120406118|12040782后mi R-30b-5p表达增加而NLRP3、IL-1β表达下降,当再对mi R-30b-5p抑制时,则NLRP3和IL-1β增加。差异具有统计学意义（P＜0.05）。4、circ RNA11:120406118|12040782/mi R-30b-5p/NLRP3机制促进Si O2诱导的巨噬细胞焦亡。在THP-1细胞中敲减circ RNA11:120406118|12040782和抑制mi R-30b-5p后使用Si O2刺激,并用Western blot、casepase-1活性实验和Annexin V-FITC/PI染色进行检验。发现Si O2刺激下,NLRP3介导的焦亡水平明显增加,表现为NLRP3、cleaved-caspase-1和cleaved-GSDMD的蛋白表达水平增加,并且caspase-1活性明显增加、焦亡细胞数比例明显增大。而在敲减了circ RNA11:120406118|12040782后NLRP3介导的焦亡受到抑制,表现为cleaved-caspase-1和cleaved-GSDMD的蛋白表达水平降低、caspase-1活性降低、焦亡细胞数比例下降。当再抑制mi R-30b-5p后则相反。差异具有统计学意义（P＜0.05）。5、Si O2激活的巨噬细胞源性circ RNA11:120406118|12040782促进成纤维细胞活化。将各组THP-1的培养上清收集并加入MRC-5细胞中,培养24h后收集MRC-5细胞进行Realtime-PCR和Western blot检测纤维化相关因子的基因和蛋白表达水平。Si O2组COL1、FN基因表达水平升高,Si O2-si-circ RNA组明显下降,当抑制mi R-30b-5p又在明显升高。差异具有统计学意义（P＜0.05）。FN、TGF-β1蛋白表达水平在Si O2刺激后升高,在转染si-circ RNA后明显下降,当抑制mi R-30b-5p又在明显升高。差异具有统计学意义（P＜0.05）。6、过表达mi R-30b-5p可减轻矽肺模型小鼠的炎症。小鼠肺组织照片和HE染色结果表明:与生理盐水组小鼠相比,Si O2组的小鼠肺组织出现损伤,有明显的炎性细胞浸润和肺泡壁增厚的现象;过表达mi R-30b-5p可明显缓解矽尘暴露所导致的小鼠肺部炎性改变。利用吉姆萨染色对各组小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞进行了计数。结果显示,矽肺组小鼠肺泡灌洗液中性粒细胞、淋巴细胞数量增多,而过表达mi R-30b-5p矽肺组小鼠肺泡灌洗液中性粒细胞有所降低。ELISA结果显示:矽肺组小鼠肺泡灌洗液中IL-1β明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;与矽肺组小鼠相比,IL-1β在过表达mi R-30b-5p矽肺组小鼠肺泡灌洗液中的含量明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。Realtime-PCR检测结果显示:与生理盐水组相比,矽肺组小鼠IL-1β的m RNA转录水平明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;与矽肺组小鼠相比,IL-1β的m RNA转录水平在过表达mi R-30b-5p矽肺组小鼠肺组织匀浆中明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。7、过表达mi R-30b-5p可降低矽肺小鼠炎症阶段肺组织焦亡水平。Realtime-PCR检测结果显示:与生理盐水组相比,矽肺组小鼠NLRP3的m RNA转录水平明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;与矽肺组小鼠相比,NLRP3的m RNA转录水平在过表达mi R-30b-5p矽肺组小鼠肺组织匀浆中明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。Western blot结果显示:矽肺组小鼠NLRP3、cleaved-caspase-1和cleaved-GSDMD蛋白水平明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;与矽肺组相比NLRP3、cleaved-caspase-1和cleaved-GSDMD蛋白水平在过表达mi R-30b-5p矽肺组小鼠中明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。8、过表达mi R-30b-5p可减轻矽尘导致的肺组织纤维化。各组的小鼠肺照片显示:与生理盐水组相比,矽肺组小鼠肺组织表面有明显的颗粒感,而过表达mi R-30b-5p后可减轻。Masson染色结果显示:在矽肺模型晚期（56天）矽肺组小鼠肺组织胶原沉积现象严重。与矽肺组小鼠相比,过表达mi R-30b-5p矽肺组小鼠肺组织胶原沉积明显减少。羟脯氨酸测量结果表明:在矽肺模型晚期,矽肺组小鼠肺组织内羟脯氨酸含量明显增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）;当过表达mi R-30b-5p后,小鼠肺组织内羟脯氨酸含量明显减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Realtime-PCR结果显示:与生理盐水组相比,矽肺组小鼠肺组织匀浆中Col-3、Fn的m RNA转录水平明显升高,而过表达mi R-30b-5p后,Col-3、Fn的m RNA转录水平显著降低,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot法结果显示:与生理盐水组相比,矽肺组小鼠肺组织中TGF-β、Vimentin蛋白水平显著升高,而过表达mi R-30b-5p矽肺组小鼠蛋白水平明显降低,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。利用免疫组化检测小鼠矽尘暴露晚期（56天）肺组织分泌COL-3情况,结果表明过表达mi R-30b-5p可以明显减少矽尘诱导的小鼠肺组织COL-3分泌。9、过表达mi R-30b-5p可降低矽肺小鼠纤维化阶段肺组织焦亡水平。Realtime-PCR结果显示:与生理盐水组相比,矽肺组小鼠肺组织匀浆中Nlrp3的m RNA转录水平明显升高,而过表达mi R-30b-5p后m RNA转录水平显著降低,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot法结果显示:与生理盐水组相比,矽肺组小鼠肺组织中NLRP3、cleaved-GSDMD的蛋白水平显著升高,而过表达mi R-30b-5p矽肺组小鼠的蛋白水平明显降低,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。免疫荧光检测小鼠矽尘暴露晚期（56天）肺组织分泌NLRP3、caspase-1和GSDMD的情况,结果表明过表达mi R-30b-5p可以明显减少矽尘诱导的小鼠肺组织NLRP3、caspase-1和GSDMD表达。结论:矽肺患者外周血血清外泌体中高表达的circ RNA11:120406118|12040782通过抑制mi R-30b-5p上调NLRP3的表达,从而促进NLRP3介导的巨噬细胞焦亡,进而加剧矽尘所致的肺部炎症纤维化。