论文部分内容阅读
抗冻蛋白(Antifreeze Protein,AFP)是一类具有非依数性降低冰点、抑制重结晶、修饰冰晶形态特性的蛋白。在结晶过程中,抗冻蛋白能降低溶液的冰点,而其熔点(一般接近0℃)基本不变;这种冰点与熔点之间的差异称为热滞活性(Thermal Hysteresis Activity,THA)。抗冻蛋白主要分成四类:鱼类抗冻蛋白、植物抗冻蛋白、昆虫抗冻蛋白、真菌及细菌抗冻蛋白。抗冻蛋白已被成功运用于食品、医学、农业等方面,具有广阔的应用前景。本文从小麦麸皮中提取了具有热滞活性的小麦麸皮抗冻蛋白(winter bran antifreeze protein,wbAFP),并进行分离纯化,对其二级结构进行了初步研究。以液料比、提取时间、缓冲液pH、缓冲液浓度、饱和硫酸铵浓度为因素,分别研究了其与蛋白提取率、THA之间的关系。单因素结果表明,除提取时间外,其余四个因素对蛋白提取率、THA有一定影响。以此为基础,设计四因素三水平中心组合试验,建立响应值与各影响因素之间的回归方程,得出最优提取条件为液料比7.5:1、缓冲液pH 7.8、缓冲液浓度29mmol/L、饱和硫酸铵浓度100%,在此条件下蛋白提取率理论值为41.46%、THA为0.0195℃;验证实验表明蛋白提取率为41.98%,THA为0.019℃,证明优化结果是可靠的。将粗提蛋白经过DEAE-cellulose-26离子交换色谱柱(2.6*18cm)、Sephadex G75凝胶过滤色谱柱(1.5*50cm)纯化后,获得两个洗脱峰,经SDS-PAGE测定,这两个洗脱峰为同一种抗冻蛋白,其分子量为11.2 kDa,热滞活性为0.169℃(浓度为5mg/mL),纯化倍数为449.99倍,产率为4.17%。对提纯的AFP进行氨基酸组成分析,得到的分子量与SDS-PAGE结果吻合;氨基酸组成表明其甘氨酸含量较高(52.08%),将该AFP与几种常见抗冻糖蛋白(Antifreeze glycoproteins,AFGP)进行相关性分析,推断其是一种与冷诱导相关的蛋白。亲水性分析结果表明:较牛血清白蛋白而言,该抗冻蛋白亲水性较强,与氨基酸结果相符合。采用圆二色光谱、傅里叶红外光谱、拉曼光谱对该小麦麸皮抗冻蛋白的二级结构进行分析。研究发现:傅里叶红外光谱与拉曼光谱的结果吻合度较高,而圆二色光谱的结果与两者有较大差异。该小麦麸皮抗冻蛋白二级结构的大致范围:α-螺旋:25-32%,β-折叠:15-24%,β-转角:33-38%,无规卷曲:13-18%。