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本实验室在前一阶段利用cDNA-AFLP技术结合RACE技术,从白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino)核雄性不育两用系中分离得到了一个与白菜核雄性不育相关的编码多聚半乳糖醛酸酶的基因BcMF9。多聚半乳糖醛酸酶的多基因家族成员在植物发育不同阶段和不同组织中表达,它们与果实成熟、细胞分离过程如果实软化、叶和花的脱落、花粉成熟等都有关。我们在前期利用RT-PCR和Northern杂交验证都表明BcMF9基因是在花粉中特异表达,而在叶片和茎等孢子体组织中不表达(数据未发表),表明其可能是一个在花粉发育中扮演重要角色的基因。为进一步验证该基因的的生物学功能,我们对BcMF9进行了核苷酸和蛋白质序列分析,并在此基础上分别构建了CaMV35S组成型表达载体pBI35S-BcMF9A和BcA9绒毡层组织特异型植物表达载体pBIA9-BcMF9A采用反义技术将其导入正常可育菜心(B.campestris ssp.chinensis var. parachinensis Tsen et Lee)中,继而,对转基因植株进行分子水平的检测,及花粉形态观察、花粉萌发能力的测定等。主要结果如下: (1) BcMF9基因DNA全长1481bp,cDNA序列全长为1286 bp利用DNAStar软件对BcMF9基因序列进行分析,发现其最大开放阅读框为1188 bp,编码395个氨基酸。BLAST搜索发现BcMF9基因cDNA全序列与拟南芥多聚半乳糖醛酸酶PGA3 mRNA序列相似性最高,为88%(1023/1161)。采用MEGA3.1软件对BcMF9与GenBank数据库中其它植物PG基因的CDS序列构建系统树,发现系统树可明显分为3个分支,BcMF9基因聚在分支C上,有研究和数据显示,这一分支上的其它基因均在花粉或花蕾中表达,初步表明BcMF9基因可能是花粉特异表达的多聚半乳糖醛酸酶基因。 (2) 构建了反义BcMF9基因的CaMV35S组成型表达载体pBI35S-BcMF9A和BcA9绒毡层组织特异型表达载体pBIA9-BcMF9A,并成功导入农杆菌LBA4404菌株中。 (3) 按本实验室已建立的白菜高效遗传转化体系,获得了12个抗卡那霉素的pBI35S-BcMF9A转基因芽系和10个pBIA9-BcMF9A转基因芽系,100多株抗性苗。对这些转基因植株和非转化菜心植株分别提取DNA和RNA,经PCR检测,结果表明转化的阳性率为90.56%。随后以转基因‘油青’菜心的对照株为阴性对照进行X-Gluc组织化学染色检测,结果显示pBI35S-BcMF9A转基因‘油青’菜心植株的叶边缘被染上了蓝色,而非转基因植株没有蓝色斑点,