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第一部分急性胰腺炎患者经凉膈散干预治疗后血清AP相关miRNAs水平波动情况分析:临床研究
目的:以四个急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)相关miRNAs(miR-155、miR-21-3p、miR-216和miR-92b)为切入点，评价凉膈散(LIANGGESAN，LGS)辅助治疗在救治AP患者中的临床疗效，寻找LGS治疗AP的关键miRNA。
方法:本研究连续性收录2017年1月至2019年12月于我院急诊及ICU病区住院治疗的106例AP患者。根据随机数字列表法分为LGS组(n=53)和对照组(n=53)，根据病情轻重程度不同分成轻症(mild acute pancreatitis，MAP)组，中重症(mild-severe acute pancreatitis，MSAP)组和重症(severe acute pancreatitis，SAP)组。对照组给予常规治疗，而LGS组在常规治疗方案的基础上，增加LGS治疗，每日一剂，分为两份，一份经口服或者胃管/鼻肠管鼻饲，一份经肛管保留灌肠，总疗程为10天。所有患者分别于入组时(T0)和治疗后第10天(T1)两个时间点，通过序贯器官功能衰竭评分(SOFA评分)、急性生理和慢性健康评分系统(APACHEⅡ评分)、床旁急性胰腺炎严重度评分(BISAP评分)、快速SOFA评分(qSOFA评分)和改良的CT严重指数评分(MCTSI评分)评价患者病情危重程度;通过RT-qPCR检测血清miR-155、miR-21-3p、miR-216和miR-92b波动情况。
结果:
1.LGS组和对照组比较:在miRNAs方面，T1时LGS组miR-92b水平明显低于对照组(t=5.710,p＜0.001)。LGS组AmiR-216(t=6.506,p＜0.001)和AmiR-92b(t=7.039,p＜0.001)均高于对照组。在危重症评分方面，LGS组AAPACHEⅡ评分(t=2.032，p=0.025)和ASOFA评分(t=2.382，p=0.011)均高于对照组。
2.MAP患者LGS亚组和对照亚组比较:在miRNAs方面，T1时LGS亚组miR-92b水平明显低于对照亚组(t=5.316，p＜0.001)。LGS亚组△miR-92b(t=1.867，p=0.035)高于对照亚组。在危重症评分方面，两亚组间比较均无差异。
3.MSAP患者LGS亚组和对照亚组比较:在miRNAs方面，T1时LGS亚组miR-92b水平明显低于对照亚组(t=4.329，p＜0.001)。LGS亚组△miR-216(t=5.141，p＜0.001)和△miR-92b(t=7.284，p＜0.001)高于对照亚组。在危重症评分方面，LGS亚组AAPACHEⅡ评分(t=1.885，p=0.034)、ASOFA评分(t=2.227，p=0.016)和AMCTSI评分(t=2.258，p=0.015)均明显高于对照亚组。
4.SAP患者LGS亚组和对照亚组比较:在miRNAs方面，T1时LGS亚组miR-92b水平明显低于对照亚组(t=1.887，p=0.034)。LGS亚组△miR-216(t=3.785，p＜0.001)、△miR-92b(t=5.737,p＜0.001)、△miR-155(t=4.068,p＜0.001)和△miR-21-3p(t=3.231,p=0.001)均高于对照亚组。在危重症评分方面，T1时LGS亚组BISAP评分明显低于对照亚组(t=1.827，p=0.038)。LGS亚组ASOFA评分(t=2.530，p=0.008)和AMCTSI评分(t=3.355，p=0.001)均明显高于对照亚组。
5.危重症评分与miRNA的相关性分析:AAPACHEⅡ评分与△miR-155的相关性最大(r=0.403，p＜0.001)。
6.LGS治疗与miRNA的相关性分析:全体纳入AP中LGS治疗与△miR-92b的相关性最大(r=0.668，p＜0.001)。而MAP、MSAP和SAP三类AP患者中均是LGS治疗与△miR-92b的相关性最大(r分别为0.455，0.695和0.681，p均＜0.001)。
7.LGS治疗与危重症评分的相关性分析:全体纳入AP中LGS治疗与ASOFA评分的相关性最大(r=0.427，p＜0.001)。而在MAP人群中LGS治疗与AAPACHEⅡ评分相关性最大(r=0.232，p＜0.001);MSAP和SAP人群中LGS治疗均是与ASOFA评分相关性最大(r分别为0.443和0.423，p均＜0.001)。
8.K-M生存曲线分析:LGS治疗并未明显减少所有AP患者死亡率(x2=1.451，p=0.228)，但明显减少了SAP组患者的死亡率(x2=4.286，p=0.038)。
结论:
1.L6S治疗后可明显降低AP患者循环miR-216、miR-92b、miR-155和miR-21-3p水平，尤其是miR-92b降幅最大。
2.LGS治疗后可明显改善AP患者APACHEⅡ评分、SOFA评分、qSOFA评分、BISAP评分和MCTSI评分，尤其是APACHEII评分和SOFA评分改善最为明显。
3.AmiR-155与AAPACHEⅡ评分的相关性最大。LGS治疗与AmiR-92b的相关性最大。MAP人群中LGS治疗与AAPACHEⅡ评分相关性最大，MSAP和SAP人群中均是LGS治疗与△SOFA评分相关性最大。
4.LGS治疗明显减少SAP组患者的死亡率。
关键词:急性胰腺炎;凉膈散;微小RNA;临床研究
第二部分凉膈散干预调控miR-92b/apelin通路改善AP细胞模型中的炎症损伤:实验研究
目的探讨miR-92b/apelin通路在凉膈散(LGS)改善急性胰腺炎(AP)细胞模型中炎症损伤中的分子机制。
方法以10nmol/L的雨蛙素毒染大鼠胰腺外分泌细胞(AR42J)构建AP细胞模型。实验分为四组:对照组，AP组，LGS组，LGS+miR-92b模拟物(mimic)组。MTT检测各组细胞活力。RT-qPCR检测各组miR-92b水平。ELISA法检测各组促炎因子(TNF-α和IL-1β)和抗炎因子(IL-10和IL-4)水平。Westernblot检测各组脂肪素(apelin)表达水平。
结果
1.小剂量的LGS对AR42J细胞有一定的促进增殖作用，而大剂量的LGS则可以抑制AR42J细胞的增殖。根据结果，为了减少LGS本身对于AR42J细胞增殖的影响，我们选择浓度为100μg/mlLGS作为后续实验剂量。
2.雨蛙素可以迅速抑制AR42J细胞的增殖，毒染36h时最为明显。而LGS明显减少24h(71.25±3.65％vs.85.65±4.87％,t=17.861,p＜0.001),36h(65.54±4.54％vs.96.54±4.58％,t=36.290,p＜0.001)和48h(79.84±5.55％vs.123.21±8.48％,t=32.301,p＜0.001)时雨蛙素对AR42J细胞的破坏损伤(p＜0.05)。
3.在雨蛙素毒染36h时，AP组TNF-α(t=57.53，p＜0.001)和IL-1β(t=57.67，p＜0.001)较对照组明显上升，而IL-10(t=58.72，p＜0.001)和IL-4(t=63.79，p＜0.001)明显下降。给予100μg/ml的LGS干预治疗后可以明显降低雨蛙素诱导AP状态下升高的TNF-α(t=32.80，p＜0.001)和IL-1β(t=21.94，p＜0.001)，以及升高AP状态下下调的IL-10(t=21.89,p＜0.001)和IL-4(t=25.61,p＜0.001)。
4.AP组内miR-92b较对照组明显升高(t=57.37，p＜0.001)，而LGS干预治疗可以明显降低雨蛙素诱导AR42J细胞AP模型中的miR-92b水平(t=32.54，p＜0.001)。
5.通过targetscan软件寻找潜在靶基因，在apelin的3UTR区域存在miR-92b的结合位点。luciferase实验验证了miR-92b与apelin的结合性。
6.相比于LGS组，LGS+miR-92bmimic组中TNF-α(t=15.27，p＜0.001)和IL-邛(t=12.83，p＜0.001)明显上升，而IL-10(t=10.64，p＜0.001)和IL-4(t=10.53，p＜0.001)明显下降。AP组apelin水平较对照组明显下降(t=32.27，p＜0.001)，而LGS可以有效提高apelin水平(t=5.338，p＜0.001)，但miR-92bmimic可以阻断LGS的这种作用(t=7.860，p＜0.001)。
结论
1.100μg/mlLGS对于AR42J细胞的增殖无明显影响。
2.LGS可以有效抑制雨蛙素的毒性作用，明显减少24h，36h和48h时雨蛙素对AR42J细胞的破坏损伤。
3.LGS干预治疗后可以明显改善AP细胞模型中的促炎-抗炎系统平衡。
4.LGS通过作用于miR-92b/apelin通路改善AP细胞模型中的炎症损伤。
目的:以四个急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)相关miRNAs(miR-155、miR-21-3p、miR-216和miR-92b)为切入点，评价凉膈散(LIANGGESAN，LGS)辅助治疗在救治AP患者中的临床疗效，寻找LGS治疗AP的关键miRNA。
方法:本研究连续性收录2017年1月至2019年12月于我院急诊及ICU病区住院治疗的106例AP患者。根据随机数字列表法分为LGS组(n=53)和对照组(n=53)，根据病情轻重程度不同分成轻症(mild acute pancreatitis，MAP)组，中重症(mild-severe acute pancreatitis，MSAP)组和重症(severe acute pancreatitis，SAP)组。对照组给予常规治疗，而LGS组在常规治疗方案的基础上，增加LGS治疗，每日一剂，分为两份，一份经口服或者胃管/鼻肠管鼻饲，一份经肛管保留灌肠，总疗程为10天。所有患者分别于入组时(T0)和治疗后第10天(T1)两个时间点，通过序贯器官功能衰竭评分(SOFA评分)、急性生理和慢性健康评分系统(APACHEⅡ评分)、床旁急性胰腺炎严重度评分(BISAP评分)、快速SOFA评分(qSOFA评分)和改良的CT严重指数评分(MCTSI评分)评价患者病情危重程度;通过RT-qPCR检测血清miR-155、miR-21-3p、miR-216和miR-92b波动情况。
结果:
1.LGS组和对照组比较:在miRNAs方面，T1时LGS组miR-92b水平明显低于对照组(t=5.710,p＜0.001)。LGS组AmiR-216(t=6.506,p＜0.001)和AmiR-92b(t=7.039,p＜0.001)均高于对照组。在危重症评分方面，LGS组AAPACHEⅡ评分(t=2.032，p=0.025)和ASOFA评分(t=2.382，p=0.011)均高于对照组。
2.MAP患者LGS亚组和对照亚组比较:在miRNAs方面，T1时LGS亚组miR-92b水平明显低于对照亚组(t=5.316，p＜0.001)。LGS亚组△miR-92b(t=1.867，p=0.035)高于对照亚组。在危重症评分方面，两亚组间比较均无差异。
3.MSAP患者LGS亚组和对照亚组比较:在miRNAs方面，T1时LGS亚组miR-92b水平明显低于对照亚组(t=4.329，p＜0.001)。LGS亚组△miR-216(t=5.141，p＜0.001)和△miR-92b(t=7.284，p＜0.001)高于对照亚组。在危重症评分方面，LGS亚组AAPACHEⅡ评分(t=1.885，p=0.034)、ASOFA评分(t=2.227，p=0.016)和AMCTSI评分(t=2.258，p=0.015)均明显高于对照亚组。
4.SAP患者LGS亚组和对照亚组比较:在miRNAs方面，T1时LGS亚组miR-92b水平明显低于对照亚组(t=1.887，p=0.034)。LGS亚组△miR-216(t=3.785，p＜0.001)、△miR-92b(t=5.737,p＜0.001)、△miR-155(t=4.068,p＜0.001)和△miR-21-3p(t=3.231,p=0.001)均高于对照亚组。在危重症评分方面，T1时LGS亚组BISAP评分明显低于对照亚组(t=1.827，p=0.038)。LGS亚组ASOFA评分(t=2.530，p=0.008)和AMCTSI评分(t=3.355，p=0.001)均明显高于对照亚组。
5.危重症评分与miRNA的相关性分析:AAPACHEⅡ评分与△miR-155的相关性最大(r=0.403，p＜0.001)。
6.LGS治疗与miRNA的相关性分析:全体纳入AP中LGS治疗与△miR-92b的相关性最大(r=0.668，p＜0.001)。而MAP、MSAP和SAP三类AP患者中均是LGS治疗与△miR-92b的相关性最大(r分别为0.455，0.695和0.681，p均＜0.001)。
7.LGS治疗与危重症评分的相关性分析:全体纳入AP中LGS治疗与ASOFA评分的相关性最大(r=0.427，p＜0.001)。而在MAP人群中LGS治疗与AAPACHEⅡ评分相关性最大(r=0.232，p＜0.001);MSAP和SAP人群中LGS治疗均是与ASOFA评分相关性最大(r分别为0.443和0.423，p均＜0.001)。
8.K-M生存曲线分析:LGS治疗并未明显减少所有AP患者死亡率(x2=1.451，p=0.228)，但明显减少了SAP组患者的死亡率(x2=4.286，p=0.038)。
结论:
1.L6S治疗后可明显降低AP患者循环miR-216、miR-92b、miR-155和miR-21-3p水平，尤其是miR-92b降幅最大。
2.LGS治疗后可明显改善AP患者APACHEⅡ评分、SOFA评分、qSOFA评分、BISAP评分和MCTSI评分，尤其是APACHEII评分和SOFA评分改善最为明显。
3.AmiR-155与AAPACHEⅡ评分的相关性最大。LGS治疗与AmiR-92b的相关性最大。MAP人群中LGS治疗与AAPACHEⅡ评分相关性最大，MSAP和SAP人群中均是LGS治疗与△SOFA评分相关性最大。
4.LGS治疗明显减少SAP组患者的死亡率。
关键词:急性胰腺炎;凉膈散;微小RNA;临床研究
第二部分凉膈散干预调控miR-92b/apelin通路改善AP细胞模型中的炎症损伤:实验研究
目的探讨miR-92b/apelin通路在凉膈散(LGS)改善急性胰腺炎(AP)细胞模型中炎症损伤中的分子机制。
方法以10nmol/L的雨蛙素毒染大鼠胰腺外分泌细胞(AR42J)构建AP细胞模型。实验分为四组:对照组，AP组，LGS组，LGS+miR-92b模拟物(mimic)组。MTT检测各组细胞活力。RT-qPCR检测各组miR-92b水平。ELISA法检测各组促炎因子(TNF-α和IL-1β)和抗炎因子(IL-10和IL-4)水平。Westernblot检测各组脂肪素(apelin)表达水平。
结果
1.小剂量的LGS对AR42J细胞有一定的促进增殖作用，而大剂量的LGS则可以抑制AR42J细胞的增殖。根据结果，为了减少LGS本身对于AR42J细胞增殖的影响，我们选择浓度为100μg/mlLGS作为后续实验剂量。
2.雨蛙素可以迅速抑制AR42J细胞的增殖，毒染36h时最为明显。而LGS明显减少24h(71.25±3.65％vs.85.65±4.87％,t=17.861,p＜0.001),36h(65.54±4.54％vs.96.54±4.58％,t=36.290,p＜0.001)和48h(79.84±5.55％vs.123.21±8.48％,t=32.301,p＜0.001)时雨蛙素对AR42J细胞的破坏损伤(p＜0.05)。
3.在雨蛙素毒染36h时，AP组TNF-α(t=57.53，p＜0.001)和IL-1β(t=57.67，p＜0.001)较对照组明显上升，而IL-10(t=58.72，p＜0.001)和IL-4(t=63.79，p＜0.001)明显下降。给予100μg/ml的LGS干预治疗后可以明显降低雨蛙素诱导AP状态下升高的TNF-α(t=32.80，p＜0.001)和IL-1β(t=21.94，p＜0.001)，以及升高AP状态下下调的IL-10(t=21.89,p＜0.001)和IL-4(t=25.61,p＜0.001)。
4.AP组内miR-92b较对照组明显升高(t=57.37，p＜0.001)，而LGS干预治疗可以明显降低雨蛙素诱导AR42J细胞AP模型中的miR-92b水平(t=32.54，p＜0.001)。
5.通过targetscan软件寻找潜在靶基因，在apelin的3UTR区域存在miR-92b的结合位点。luciferase实验验证了miR-92b与apelin的结合性。
6.相比于LGS组，LGS+miR-92bmimic组中TNF-α(t=15.27，p＜0.001)和IL-邛(t=12.83，p＜0.001)明显上升，而IL-10(t=10.64，p＜0.001)和IL-4(t=10.53，p＜0.001)明显下降。AP组apelin水平较对照组明显下降(t=32.27，p＜0.001)，而LGS可以有效提高apelin水平(t=5.338，p＜0.001)，但miR-92bmimic可以阻断LGS的这种作用(t=7.860，p＜0.001)。
结论
1.100μg/mlLGS对于AR42J细胞的增殖无明显影响。
2.LGS可以有效抑制雨蛙素的毒性作用，明显减少24h，36h和48h时雨蛙素对AR42J细胞的破坏损伤。
3.LGS干预治疗后可以明显改善AP细胞模型中的促炎-抗炎系统平衡。
4.LGS通过作用于miR-92b/apelin通路改善AP细胞模型中的炎症损伤。