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目前中风在全世界是第二大成人死因,造成长期残疾的主要病因。脑中风可分为两大类:出血性和缺血性中风。其中缺血性大约占70-80%。缺血性脑损伤涉及到复杂的病理生理机制,包括兴奋性氨基酸中毒、离子稳态破坏、氧自由基损伤、炎症反应以及细胞凋亡等机制。目前在对心脏的研究中已发现缺血预处理(Ischemic preconditioning,IPC)能减少缺血损伤,抑制细胞凋亡促进功能恢复。但缺血预处理的脑保护机制仍不清楚。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphoinositide-3 kinase) PI3K/Akt细胞内信号途径具有促进细胞增殖分化,调节细胞存活等广泛的生物学效应。研究提示PI3K/Akt信号通路在缺血预处理中起非常重要的调控作用。Bcl-2家族中的MCL-1作为一个重要的抗凋亡成员,在细胞的生存与凋亡的调控中发挥重要作用,然而MCL-1是否参与缺血预处理抑制细胞凋亡并在其中发挥重要作用目前国内外未见相关报道。本研究旨在通过建立大鼠脑缺血预处理(Cerebral ischemic preconditioning, CIPC)模型,应用特异性抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt信号通路和GSK3β抑制剂氯化锂抑制GSK3β活性,研究脑缺血预处理后海马组织中PI3K/Akt信号通路中磷酸化Akt、PDK1、GSK3β和PP2A、MCL-1表达的变化,探讨PI3K/Akt/GSK3β信号通路在脑缺血预处理中的调控作用。第一部分脑缺血预处理动物模型的建立及对海马神经元细胞的凋亡影响目的:建立SD大鼠局灶-局灶的脑缺血耐受模型,考察CIPC通过PI3K/Akt/GSK3β信号途径对海马神经元凋亡的影响,从行为学、组织学及神经元凋亡等方面研究脑缺血预处理(CIPC)所诱导的内源性神经保护作用。方法:以短暂大脑中动脉缺血(MCAO)作为局灶性CIPC,利用改良的二次线栓法先后给予SD大鼠3×10 min CIPC,间隔1天后给予24h MCAO后处死。健康雄性SD大鼠随机分为五组:假手术组(Sham),脑缺血组(IS),脑缺血+脑缺血预处理组(CIPC),脑缺血+脑缺血预处理组+PI3K特异性抑制剂LY294002组(LY294002),脑缺血+脑缺血预处理+GSK3β特异性抑制剂氯化锂组(LiCL)。运用Bederson神经功能缺损评定法、TTC染色及TUNEL等方法观察各组神经功能缺损、梗死体积和组织凋亡变化。结果:与缺血组大鼠相比,CIPC组大鼠神经功能缺失明显减轻(P<0.05),脑梗死体积明显减少(P<0.05),海马凋亡细胞明显减少(P<0.05);给予PI3K特异性抑制剂LY294002后可以抵消CIPC的保护作用。CIPC基础上给予GSK3β特异性抑制剂氯化锂可以使大鼠神经功能缺失进一步减轻(P<0.05),脑梗死体积明显减少(P<0.05),海马凋亡细胞明显减少(P<0.05)。结论:缺血预处理组对再次缺血可产生脑保护作用,增强脑组织对脑缺血的耐受能力。LY294002特异性阻断PI3K/Akt通路,CIPC的脑保护作用被抵消。脑缺血预处理前联合应用氯化锂干预,可进一步减轻神经细胞凋亡,对神经保护有叠加作用。说明CIPC是通过PI3K/Akt/GSK3β通路的激活来发挥神经保护作用的。关键词:脑缺血预处理模型凋亡PI3K/Akt/GSK3β第二部分PI3K/Akt/GSK3β信号通路在脑缺血预处理中的脑保护作用机制目的:研究脑缺血预处理(CIPC)中PI3K/Akt/GSK3β信号通路调节变化,初步确定大鼠缺血预处理的保护作用是否与海马PI3K/Akt及GSK-3β的磷酸化有关。方法:健康雄性SD大鼠随机分为五组:假手术组(Sham),脑缺血组(IS),脑缺血+脑缺血预处理组(CIPC),脑缺血+脑缺血预处理组+PI3K特异性抑制剂LY294002组(LY294002),脑缺血+脑缺血预处理+GSK3β特异性抑制剂氯化锂组(LiCL)。应用Western blotting检测p-PDK1、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β(ser9)、MCL-1的蛋白表达,RT-PCR检测GSK3β、PP2A的转录。结果:与缺血组相比,脑缺血预处理能增加P-PDK1、P-Akt、MCL-1 P-GSK-3β(ser9)表达(P<0.05)。脑缺血预处理的此效应也可以被PI3K特异性抑制剂LY294002所废止。与缺血组及预处理组相比较,氯化锂能增加p-Akt、MCL-1、p-GSK-3β(ser9)表达(P<0.05)。与假手术组比较,脑缺血组及LY294002组均增加PP2A的mRNA水平的转录(P<0.05),CIPC降低了PP2A的转录,氯化锂干预对PP2A的mRNA水平的转录表达无影响(P>0.05)。与缺血组比较,CIPC提高了GSK-3βmRNA水平的转录(P<0.05)。结论:脑缺血预处理可通过激活PI3K/Akt/GSK3β途径,增强p-PDK1表达、抑制PP2A表达,促进Akt的活化,增加p-GSK3β的表达,进而提高MCL-1表达。减轻脑缺血损伤,发挥脑保护作用。第三部分:脑缺血预处理通过PI3K/Akt/GSK3β信号通路抑制线粒体凋亡途径目的:探讨大鼠持续性脑缺血后在缺血海马脑组织中线粒体通透性转换孔开放、caspase-9及caspase-3激活的特点;并在此基础上进一步研究缺血预处理是否通过PI3K/Akt/GSK3β通路抑制线粒体凋亡途径,从而减轻缺血性脑损伤。方法:健康雄性SD大鼠随机分为五组:假手术组(Sham),脑缺血组(IS),脑缺血+脑缺血预处理组(CIPC),脑缺血+脑缺血预处理组+PI3K特异性抑制剂LY294002组(LY294002),脑缺血+脑缺血预处理+GSK3β特异性抑制剂氯化锂组(LiCL)。脑缺血预处理给予3×10min间隔7min方案,再灌注24小时后制备pMCAO模型。在缺血后24小时,用Western blot进一步检测caspase-9及caspase-3表达水平;分光光度法测定各组大鼠海马缺血神经元MPTP的开放度。结果:sham组海马神经元中caspase-3,9的表达量极少。与Sham组相比较,IS组明显增加MPTP开放及caspase-3,9蛋白的表达(P<0.05)。与IS组相比较,脑缺血预处理能减少MPTP开放、降低caspase-3,9的表达(P<0.05)。同样,PI3K特异性抑制剂LY294002可以抵消脑缺血预处理抑制凋亡的效应。GSK3β特异性抑制剂氯化锂减少MPTP开放、降低caspase-3,9的表达。结论:持续性脑缺血诱导海马缺血脑组织神经元线粒体MPTP的开放和caspase-3,9的激活;脑缺血预处理可通过激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路抑制线粒体MPTP的开放和caspase-3,9的激活,抑制线粒体凋亡途径,减少脑缺血造成神经元的死亡,这可能是缺血预处理减轻缺血性脑损伤的机制之一。