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目的:N6腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine,m~6A）是真核生物mRNA最常见的表观遗传修饰。本课题主要研究m~6A去甲基化酶Alkbh5在髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）中的生物学作用,并初步探讨其调控机制,为针对MDSCs的免疫疗法提供新的实验依据。方法:（1）采用皮下注射的方法构建小鼠CT26结肠癌移植瘤模型,免疫磁珠法分选小鼠脾脏来源MDSCs细胞,流式细胞术（flow cytometry,FCM）鉴定细胞纯度和细胞活性。比色法检测荷瘤发展不同阶段小鼠MDSCs中m~6A水平的变化。m~6A去甲基化酶主要包括α-酮戊二酸依赖性双加氧酶alk B同源物5（α-ketoglutarate-dependent dioxygenase alk B homolog 5,Alkbh5）、脂肪和肥胖相关蛋白（fat-mass and obesity-associated protein,FTO）,采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）检测荷瘤小鼠MDSCs中Alkbh5和FTO的mRNA表达水平,蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）检测Alkbh5和FTO的蛋白表达水平。（2）为探究Alkbh5在MDSCs中可能的生物学作用,利用转录组测序（RNA-sequencing）筛选敲减Alkbh5后MDSCs中差异表达基因,测序结果显示MDSCs发挥免疫抑制功能的直接效应分子精氨酸酶-1（Arginase-1,Arg-1）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）表达有显著差异。为验证测序结果,我们将小鼠Alkbh5特异si RNA（si Alkbh5）转入MDSCs(MDSCssi Alkbh5),q RT-PCR检测MDSCssi Alkbh5中Arg-1和NOS2（i NOS）的mRNA表达情况,比色法和Griess偶联法检测Arg-1活性和NO含量。将小鼠Alkbh5过表达慢病毒载体转入MDSCs(MDSCs Alkbh5),同样利用q RT-PCR检测Arg-1和NOS2的mRNA表达情况,比色法和Griess偶联法分别检测MDSCs Alkbh5中Arg-1活性和NO含量。NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索小鼠Arg-1 mRNA和NOS2 mRNA序列,将序列输入SRAMP数据库（http://www.cuilab.cn/sramp/）预测Arg-1 mRNA和NOS2mRNA上是否具有m~6A修饰位点。RIP实验富集与Alkbh5结合的mRNA,q RT-PCR检测Arg-1和NOS2的mRNA表达水平。Me RIP-PCR分别检测MDSCssi Alkbh5和MDSCs Alkbh5细胞中Arg-1 mRNA和NOS2 mRNA上m~6A水平。放线菌素D阻断细胞中mRNA合成,q RT-PCR分别检测MDSCssi Alkbh5和MDSCs Alkbh5细胞中Arg-1 mRNA稳定性变化。Western blot检测MDSCssi Alkbh5和MDSCs Alkbh5细胞中Arg-1蛋白表达。（3）采用CFSE标记法建立体外CD4+T细胞增殖体系,用于分析MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用。分选荷瘤发展不同阶段小鼠脾脏MDSCs,将其与CD4+T细胞共培养,FCM检测MDSCs对CD4+T细胞增殖的影响。为探索Alkbh5对MDSCs免疫抑制功能的影响,我们分别将Alkbh5特异si RNA或Alkbh5过表达慢病毒载体转入MDSCs,以同样方法检测MDSCssi Alkbh5和MDSCs Alkbh5对CD4+T细胞增殖的抑制作用。（4）将Alkbh5特异si RNA或Alkbh5过表达慢病毒载体转入MDSCs,收集细胞,将1×10~6MDSCssi Alkbh5或1×10~6 MDSCs Alkbh5分别与1×10~6CT26细胞混合,皮下注射,构建小鼠结肠癌移植瘤模型。动态观察肿瘤生长情况,测量肿瘤大小,第23天处死小鼠,剥离肿瘤组织拍照并称重。FCM检测脾脏、肿瘤局部淋巴结、肿瘤组织中CD3+CD4+IFN-γ+T（Th1）细胞和CD3+CD8+IFN-γ+T（CTL）细胞的比例变化。结果:（1）分选自荷瘤小鼠脾脏的MDSCs细胞纯度为94.40%,细胞活性大于95.00%。与野生型小鼠MDSCs相比,3周荷瘤小鼠MDSCs中m~6A水平是其2.00倍,5周荷瘤小鼠MDSCs中m~6A水平为3周荷瘤小鼠MDSCs的2.00倍,表明荷瘤小鼠MDSCs中m~6A水平高于野生型小鼠,且随着荷瘤进展m~6A水平进一步升高（P＜0.05）。检测MDSCs中m~6A去甲基化酶表达情况后发现,荷瘤小鼠脾脏MDSCs中去甲基化酶Alkbh5的mRNA和蛋白水平明显低于野生型小鼠MDSCs（P＜0.05）,并且5周荷瘤小鼠脾脏MDSCs中Alkbh5的表达低于3周荷瘤小鼠MDSCs（P＜0.05）;而去甲基化酶FTO的表达无明显差异。结果表明,荷瘤小鼠脾脏MDSCs中m~6A水平随荷瘤进展显著升高,去甲基化酶Alkbh5表达下调。（2）敲减MDSCs中Alkbh5表达后,转录组测序结果显示,有159个基因的转录水平呈现显著差异,其中122个基因转录上调,37个基因转录下调。我们去除表达量极低且无潜在m~6A修饰位点的基因,结合文献阅读,筛选出与MDSCs有关的基因。进一步分析后发现,这些基因在影响MDSCs免疫抑制功能方面显著富集,其次为MDSCs趋化和分化发育过程,提示Alkbh5在MDSCs免疫抑制功能方面可能发挥重要的调控作用。进一步分析与MDSC免疫抑制功能相关的基因后发现,MDSCs发挥免疫抑制功能的直接效应分子Arg-1、NOS2（i NOS）mRNA显著上升。接下来,我们进一步验证了MDSCs中Alkbh5是否调控Arg-1和i NOS的表达。采用Alkbh5特异si RNA敲减MDSCs中Alkbh5后,与对照细胞相比,MDSCssi Alkbh5细胞中Arg-1 mRNA水平是对照细胞的3.90倍（P＜0.05）,NOS2 mRNA水平是对照细胞的5.30倍（P＜0.05）;Arg-1活性是对照细胞的1.25倍（P＜0.05）,NO含量是其1.19倍（P＜0.05）。在MDSCs中过表达Alkbh5后,发现MDSCs Alkbh5细胞中Arg-1 mRNA水平降低了55.60%（P＜0.05）,NOS2 mRNA水平降低了50.00%（P＜0.05）;检测Arg-1活性和NO含量后发现,MDSCs Alkbh5细胞中Arg-1活性降低了80.00%（P＜0.001）,NO含量降低了66.00%（P＜0.05）。以上结果表明Alkbh5能够显著降低MDSCs效应分子Arg-1和i NOS的表达及活性。为进一步研究Alkbh5是否影响Arg-1 mRNA和NOS2 mRNA上的m~6A修饰水平,我们利用SRAMP数据库进行预测,结果显示Arg-1 mRNA和NOS2 mRNA上存在m~6A修饰位点。利用RIP-PCR检测,发现MDSCs细胞中Alkbh5可直接与Arg-1 mRNA、NOS2mRNA结合。Me RIP-PCR检测结果显示MDSCssi Alkbh5中Arg-1 mRNA上m~6A水平是对照细胞的2.69倍（P＜0.05）,NOS2 mRNA上m~6A水平无变化。MDSCs Alkbh5中Arg-1mRNA上m~6A水平较对照细胞下降了63.60%（P＜0.05）,NOS2无变化。结果表明Alkbh5可下调Arg-1 mRNA上m~6A修饰水平,但对NOS2 mRNA上的m~6A修饰无直接调控作用,还需后续实验寻找可能的原因。m~6A修饰在mRNA的剪接、稳定性、代谢等过程中均发挥调控作用。为进一步探讨Alkbh5介导的m~6A修饰对Arg-1 mRNA稳定性的影响,我们在MDSCs中转染Alkbh5特异si RNA或Alkbh5过表达慢病毒载体。结果显示MDSCssi Alkbh5中Arg-1 mRNA降解速率较对照细胞减缓了40.00%。MDSCs Alkbh5中Arg-1 mRNA降解速率较对照细胞加快了42.00%,表明Alkbh5可下调Arg-1 mRNA稳定性。Western blot检测结果显示,MDSCssi Alkbh5中Arg-1蛋白表达显著升高,而在MDSCs Alkbh5中Arg-1蛋白表达水平明显降低。以上结果表明,Alkbh5通过下调Arg-1 mRNA上m~6A修饰降低其mRNA稳定性和蛋白表达。（3）检测小鼠荷瘤发展不同阶段MDSCs的免疫抑制功能,发现5周荷瘤小鼠MDSCs抑制CD4+T细胞增殖的能力明显强于3周荷瘤小鼠MDSCs（P＜0.05）。为进一步验证Alkbh5能否调控MDSCs的免疫抑制功能,我们利用si RNA敲减MDSCs中Alkbh5表达,结果显示MDSCssi Alkbh5抑制CD4+T细胞增殖的作用明显增强（P＜0.05）。将小鼠Alkbh5过表达慢病毒载体转入MDSCs,发现MDSCs Alkbh5抑制CD4+T细胞增殖的作用明显低于对照细胞（P＜0.05）。以上结果表明Alkbh5通过下调MDSCs效应分子Arg-1、i NOS表达降低其免疫抑制功能。（4）与对照组相比,MDSCssi Alkbh5组肿瘤生长明显快于对照组,体积增大且重量增加（P＜0.05）,小鼠脾脏、肿瘤局部淋巴结及肿瘤组织中CD3+CD4+IFN-γ+T（Th1）细胞和CD3+CD8+IFN-γ+T（CTL）细胞比例明显降低（P＜0.05）。MDSCs Alkbh5组肿瘤生长明显减缓,体积减小且重量明显减轻（P＜0.05）,CD3+CD4+IFN-γ+T（Th1）细胞和CD3+CD8+IFN-γ+T（CTL）细胞比例明显升高（P＜0.05）。表明Alkbh5能够通过下调MDSCs的免疫抑制功能延缓肿瘤进展。结论:在小鼠荷瘤发展过程中,MDSCs细胞中Alkbh5表达降低,导致Arg-1 mRNA上m~6A修饰水平升高,增加其mRNA稳定性和蛋白表达,从而增强MDSCs的免疫抑制功能,促进肿瘤生长。