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目的： 通过克隆技术将真氧产碱杆菌大质粒pMOL30上铬抗性调节基因chrB（ChrB是调节蛋白，调节铬转运蛋白 ChrA的表达）与增强型荧光蛋白基因 mTagbfp2融合，连接到pEASY-Blunt T Zero，以DH5α为宿主菌，构建了一株对铬特异性响应的全细胞微生物传感器；此外，本文利用基因工程技术将铬抗性调节基因chrB与pET28b质粒连接，同时将chrB与蛋白膜表达元件Lpp-OmpA融合后克隆至pET28b载体中，以BL21为宿主菌，构建了两株能有效吸附六价铬的全细胞微生物除污菌株。以上研究，为微生物在重金属环境 Cr（VI）污染的检测和修复领域的研究提供了基础。 方法： 1.构建重金属Cr（VI）全细胞微生物质粒型检测菌株 1.1通过PCR扩增技术从真氧产碱杆菌中扩增得到铬特异性相应蛋白基因chrB和启动子 PchrA，再通过交叉PCR技术将 chrBPchrA与增强型型蓝色荧光蛋白基因 mTagbfp2和增强型绿色荧光蛋白 egfpmut2基因重组融合，并进一步与 pEASY Blunt T Zero克隆载体连接构建以PchrA为单启动子的质粒型报告菌株； 1.2两种荧光蛋白质粒型报告菌株的比较通过将两株菌在LB中长到相同的OD值0.1左右，分装等体积加入不同浓度的铬金属离子进行诱导检测，观察这两种荧光强度对金属离子浓度依赖性强弱，即荧光强度的高低； 1.3增强型蓝色荧光蛋白基因 mTagbfp2为报告基因的检测菌株检测条件的优化及相关参数的确定，包括特异性、诱导动力学实验，最适检测范围的确定 1.3.1最佳诱导OD值 通过将pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DH5α菌株分别在OD值为0.1、0.2和0.4的时候对其进行诱导，以查看其荧光强度对不同浓度的金属铬离子的依赖性； 1.3.2最佳诱导时间将检测菌株在0.1的诱导起始OD条件下，加入1 mmol/L终浓度的K2CrO4，诱导1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，比较其不同诱导时间下的荧光强度的大小； 1.3.3适宜宿主菌的筛选通过将质粒pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2导入到经冷氯化钙法制备的野生型MC4100感受态菌株中，与pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DH5α菌株以相同的条件进行诱导，观察两株菌株荧光蛋白表达的强弱； 1.3.4不同价态的铬对检测菌株的诱导影响在相同条件下将pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DHα检测菌经过相同系列浓度的KCl3、K2CrO4、K2Cr2O4诱导，观察其对不同价态铬响应的浓度依赖性； 1.3.5检测菌株的检测特异性通过将菌株pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DH5α在100μmol/L浓度下的Cr6+、As3+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Cu2+、Fe2+、Hg2+、Ni2+和 Co2+进行相同条件的诱导，观察检测菌株对 Cr6+离子的响应特异性； 1.3.6检测菌株的检测线性将检测菌株在0、1.0×10-5、2.0×10-5、4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、1.8×10-4和2.0×10-4 mol/L浓度下进行诱导观察其对Cr6+的线性范围。 2.构建重金属Cr（VI）全细胞微生物除污菌株 2.1通过PCR从构建好的质粒pBAD-LO-chrB中将chrB和融合基因LO-chrB基因扩增出来，另外，用Nco I和Hind III酶对pET28b质粒进行消化，对消化质粒进行胶回收，与chrB基因片段和LO-chrB基因进行重组融合，构建成两个除污质粒pET28b-chrB和pET28b-LO-chrB,前者是在胞内表达除污蛋白chrB，后者是在细菌膜表面表达除污蛋白。 2.2除污蛋白chrB和LOchrB的表达将除污菌株在200μmol/L终浓度的IPTG中诱导表达0 h、2 h、6 h、12 h和24 h，收集菌体调整OD值一致（OD为10的菌上样量10-15μl），跑SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色观察除污蛋白随着诱导时间的延长表达量的变化，另外用Western Blot验证目的蛋白的表达；2.3通过对胞内除污蛋白表达菌株在500 ml LB诱导表达蛋白吸附铬后进行蛋白纯化且用ICP-MS检测蛋白中结合的铬含量； 2.4除污菌株Cr（VI）吸附条件的探索分别将除污蛋白膜表达菌株固定铬浓度采用不同吸附时间以及固定时间采用不同浓度铬吸附探究除污菌株最佳铬的吸附时间和浓度； 2.5除污菌株的除污性能的比较 2.5.1将胞内除污蛋白表达菌株与膜表达除污蛋白菌株相同系列铬浓度的条件下进行铬吸附量的比较，确定优势吸附菌株。 2.5.2将胞内除污蛋白表达菌株与膜表达除污蛋白菌株在含有50μmol/L的六价铬20mmol/L Tris-HCl pH6.8的模拟水样中进行吸附实验。 结果： 1.成功构建了重金属Cr（VI）全细胞微生物质粒型检测菌株 1.1通过交叉PCR和无缝克隆技术，成功构建了pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DH5α和pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-egfpmut2/DH5α两株质粒型报告菌株。 1.2两种荧光蛋白质粒型报告菌株的比较 将两株菌在相同条件下诱导，发现1×10-3、2.5×10-3和5×10-3 mol/L的K2Cr2O4都能较好地启动pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagBFP2/DH5α中的mTagBFP2蛋白的表达，而且信号明显高于pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-egfpmut2/DH5α的荧光强度。 1.3增强型蓝色荧光蛋白mTagBFP2为报告分子的检测菌株检测条件的优化及相关参数的确定，包括特异性、诱导动力学实验，最适检测范围的确定 结果发现以蓝色荧光蛋白基因为报告基因的菌株对铬（VI）的响应能力较强；且该菌株在LB中的最佳诱导OD值为0.1；最佳诱导时间为4 h；该检测质粒在DH5α中的检测性能优于野生型MC4100，CrCl3、K2CrO4、K2Cr2O4均能诱导检测菌株产生荧光蛋白，且重铬酸钾能够以相对较低的浓度使检测菌响应，但是铬酸钾对检测菌的诱导产生的最大信号最高；CrCl3传感器的诱导效应较弱；检测菌株能够对铬产生特异性响应；响应线性在20-140μmol/L的范围内，线性相关系数为R=0.99243。 2.构建重金属Cr（VI）全细胞微生物除污菌株 2.1结果显示成功构建了膜内除污蛋白表达菌株和膜上除污蛋白表达菌株； 2.2结果显示胞内和膜上除污蛋白表达菌株的蛋白表达量随着诱导时间的延长而增加，WB验证除污蛋白已成功表达； 2.3结果显示调节蛋白铬的结合量为每个蛋白分子结合1个铬离子； 2.4结果显示膜上表达除污蛋白菌株对铬的吸附量随着铬浓度及吸附时间的延长而增加； 2.5结果显示胞内表达除污蛋白菌株对铬的吸附能力优于膜上表达除污蛋白的除污菌株，前者的吸附量约为后者吸附量的3倍。在50μmol/L的六价铬20mmol/L Tris-HCl pH6.8的模拟水样中进行吸附的结果显示，膜表面表达蛋白的除污菌株的吸附性能高于膜内表达蛋白的除污菌株。 结论： 1.成功构建检测Cr（VI）的pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DH5α微生物全细胞质粒型检测菌株，其检测的最适起始OD值为0.1，最佳诱导时间为4 h，能特异性检测 Cr（VI），检测线性范围为20-140μmol/L，线性相关系数为R=0.99243。 2.成功构建了有效吸附铬的基因工程菌株pET28-chrB/BL21和pET28-LO-chrB/BL21，且菌株对铬的吸附量能够随着调节蛋白ChrB诱导表达的增加和吸附时间的延长而增加，在50μmol/L和100μmol/L的吸附环境中对铬的吸附量显示膜内表达优于膜外表达菌株。而将菌株用于模拟水样的吸附时，膜外蛋白表达菌株优于膜内蛋白表达菌株。