论文部分内容阅读
背景及目的： 脲原体属于柔膜纲支原体目支原体科，是一类缺乏细胞壁能独立生存的原核细胞型微生物。脲原体常寄居在人类泌尿道、生殖道，引起泌尿道、生殖道感染，尤其在性活跃的女性中脲原体检出率更高，可引起女性不孕、孕妇早产甚至流产。过去主要对成人泌尿生殖道的脲原体进行研究，对于脲原体在婴儿呼吸道中的定植与感染的深入研究还较少，婴儿脲原体定植或感染相对成人而言又有其独特性，在感染的分布、药物敏感性、临床抗菌药物的使用等方面都存在着不同。有研究者认为不同群不同型的脲原体可能在致病性和耐药性等方面存在差异。Toll样受体（TLRs）作为固有免疫应答反应中启动炎症反应的“门户”蛋白，其信号通路参与病原微生物相互识别和作用，促进前炎症细胞因子和趋化因子分泌（如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等），从而引发机体的炎症反应及免疫应答。 本文通过对浙大附属儿童医院婴儿呼吸道分离的脲原体进行研究，旨在了解本地区婴儿呼吸道脲原体生物群构成与耐药情况，为婴儿脲原体感染的防治工作提供一定的理论依据。通过对不同生物群脲原体感染Ⅱ型肺泡上皮细胞株A549进行研究，初步了解脲原体对A549细胞生长的影响，以及对细胞表面TLRs表达的调控；研究不同生物群脲原体对TLRs表达的调控是否存在差异，探讨炎症应答上游信号通路TLRs在识别脲原体和参与免疫反应的机制，对进一步明确脲原体的耐药性、致病性和流行情况，指导临床治疗有重要的意义。 方法： 1.收集2012年11月1日至2015年12月1日分离自婴儿呼吸道的咽拭子（或痰液）标本，共1140份呼吸道标本，对其进行脲原体培养鉴定和药敏检测。 2.对成功冻存并复苏的78株脲原体菌株进行生物分群、红霉素耐药基因和主动外排泵基因的检测。 3.利用脲原体标准菌株血清型4感染A549细胞，分别作用24 h、48 h、72 h，光学显微镜下观察脲原体对A549细胞生长形态的影响。 4.取脲原体生物1群和生物2群临床分离菌株以及标准菌株血清型3和血清型4各1株，分别刺激A549细胞，采用RT-PCR检测细胞TLRs mRNA的表达情况。 结果： 1.78株脲原体培养阳性，其中48株（61.54％）分离自早产儿；生物1群51株，占65.38%，生物2群27株，占34.62%。不同生物群脲原体在患儿性别、是否早产儿、年龄、出生胎龄、出生体重及住院天数等方面差异均无统计学意义（P＞0.05）。 2.78株脲原体对环丙沙星和氧氟沙星的耐药率较高，均为80.77%；对四环素的耐药率为1.28%；对多西环素、交沙霉素和原始霉素高度敏感，均为100%；对大环内酯类抗生素（红霉素、阿奇霉素和克拉霉素）耐药率较低，均<12%。不同生物群脲原体对这9种抗生素的耐药率差异均无统计学意义（P＞0.05）。 3.仅有甲基化酶耐药基因（ermB）、主动外排泵可转移耐药基因（msrA/B）阳性扩增，检出率分别为39.74%和12.82%。ermB主要存在于生物2群，检出率为55.56%（P＜0.05），msrA/B在脲原体两大生物群中分布较均衡（P＞0.05）。 4.78株脲原体分别来自新生儿败血症24例，先天感染性肺炎30例，早产儿视网膜病9例，新生儿颅内出血9例，支气管肺发育不良15例。不同生物群脲原体在这些疾病中的分布差异均无统计学意义（P＞0.05） 5.浓度为108copy/ml的脲原体标准菌株血清型4与A549细胞共培养，24 h后置光学显微镜下观察，处理组与对照组细胞形态没有显著差别，48 h和72 h后均发现细胞皱缩、体积变小并脱落，皱缩和脱落细胞的数量随着培养时间的增加而增加。 6.标准菌株血清型3感染A549细胞后，与未处理组比较，发现TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6和TLR10表达水平增加（P＜0.05），TLR5、TLR7、TLR8和TLR9的表达与未处理组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。脲原体标准菌株血清型4感染A549细胞增加了TLR1、TLR2、TLR3和TLR6的表达（P＜0.05），TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10的表达与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。脲原体标准菌株血清型3属于生物1群，标准菌株血清型4属于生物2群，两组比较TLRs表达差异无统计学意义（P＞0.05）。 7.脲原体临床菌株生物1群刺激 A549细胞后，与未处理组比较，发现 TLR1、TLR2、TLR3和 TLR7表达水平增加（P＜0.05），TLR4、TLR5、TLR6、TLR8、TLR9和 TLR10的表达与未处理组比较差异无统计学意义(P＞0.05）。临床菌株生物2群刺激A549细胞上调了TLR1、TLR2、TLR3、TLR6和TLR8的表达（P＜0.05），TLR4、TLR5、TLR7、TLR9和TLR10的表达与未处理组比较差异无统计学意义(P＞0.05）。不同生物群临床菌株两组比较，TLRs表达差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论： 1.婴儿呼吸道分离的脲原体以生物1群为主，在早产儿中的检出率更高。 2.脲原体两大生物群对环丙沙星和氧氟沙星耐药率较高，对大环内酯类抗生素红霉素、阿奇霉素和克拉霉素耐药率较低，可作为治疗婴儿脲原体感染的首选药物。 3.红霉素耐药基因ermB主要分布在生物2群。 4.新生儿败血症、先天感染性肺炎、早产儿视网膜病、新生儿颅内出血、支气管肺发育不良等疾病在脲原体生物1群和生物2群的分布基本相同。 5.浓度为108copy/ml的脲原体呈时间依赖性抑制A549细胞生长，改变细胞形态。 6.脲原体感染A549细胞后以上调TLR1、TLR2、TLR3和TLR6的表达为主。